翁銳強(qiáng)，潘　磊，彭卉彤，呂成定，鄧　寧(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院抗體工程研究中心，廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實驗室，廣東廣州510632)

VEGF/bFGF復(fù)合多肽疫苗對雌性小鼠的毒性及其生殖的影響*

翁銳強(qiáng)，潘磊，彭卉彤，呂成定，鄧寧△
(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院抗體工程研究中心，
廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實驗室，廣東廣州510632)

［摘要］目的:初步探究血管內(nèi)皮生長因子( VEGF) /堿性成纖維細(xì)胞生長因子( bFGF)復(fù)合多肽疫苗( VEGF/bFGF complex peptide vaccine，VBP3)對雌性小鼠的毒性及其生殖的影響。方法:通過鎳離子親和層析柱純化VBP3蛋白，將純化獲得的VBP3免疫雌性BALB/c小鼠，酶聯(lián)免疫吸附實驗( ELISA)方法檢測小鼠血清抗體效價和特異性，監(jiān)測親本小鼠體重，測定親本小鼠臟器重量并對小鼠臟器進(jìn)行HE染色觀察;將免疫小鼠與未免疫雄性小鼠交配后，測定F1代小鼠存活率、體重、相關(guān)臟器重量，并對相關(guān)臟器進(jìn)行HE染色觀察。結(jié)果:間接ELISA檢測結(jié)果顯示免疫小鼠血清中抗VEGF、抗bFGF抗體滴度分別為1∶3 000、1∶20 000，且免疫組F1代小鼠能檢測出低滴度的抗bFGF抗體，但抗VEGF抗體不能檢出。在小鼠生產(chǎn)率實驗中，免疫組與對照組崽鼠數(shù)目未見明顯差異，但免疫組F1代小鼠存活率較對照組降低( P＜0.05)。在親本小鼠中，免疫組小鼠各臟器重量與對照組比較均未有差異，而在F1代小鼠中，2個組別的小鼠肝臟重量存在差異，但其它臟器重量未有差異; HE染色顯示，在親本小鼠中，2個組別小鼠的各臟器形態(tài)未有明顯差異;在F1代小鼠中，免疫組F1代小鼠的肝臟與對照組相比存在形態(tài)差異。結(jié)論: VEGF/bFGF復(fù)合多肽疫苗未對親本小鼠主要臟器造成直接損傷，但對親本小鼠的生殖及F1代小鼠健康具有一定的影響。

［關(guān)鍵詞］血管內(nèi)皮生長因子;堿性成纖維細(xì)胞生長因子;多肽疫苗

在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等一系列的生理活動中，新血管的形成是必不可少的，因此在癌癥研究領(lǐng)域中，以抑制血管的新生途徑被認(rèn)為是一種重要的、而且有效的抗癌模式［1］。在腫瘤血管新生機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)有許多相關(guān)的促血管新生因子，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子( basic fibroblast growth factor，bFGF)是目前研究最多的促血管新生因子。腫瘤血管新生的機(jī)制，bFGF與VEGF具有協(xié)同作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌血小板衍生因子( plateletderived growth factor，PDGF)及其受體PDGFRβ，啟動PDGF-B-PDGFRβ信號促進(jìn)腫瘤血管的生長成熟，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移［1-2］。因此，同時抑制VEGF及bFGF兩者的信號途徑，阻斷與其受體結(jié)合可以抑制腫瘤及腫瘤血管的發(fā)生發(fā)展，為腫瘤的治療提供更為有效的模式。

VEGF/bFGF復(fù)合多肽疫苗( VEGF/bFGF complex peptide vaccine，VBP3)作為一種同時靶向VEGF和bFGF的腫瘤疫苗，它能夠在機(jī)體體內(nèi)刺激或誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生抗體發(fā)揮作用。疫苗作為一種特殊的生物制品，其有效性和安全性是疫苗使用價值的2個重要參考。理想狀體下的疫苗是對正常機(jī)體不會產(chǎn)生毒副作用的，但由于疫苗本身并不直接發(fā)揮作用，而是對機(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行刺激進(jìn)而發(fā)揮作用，因此，在疫苗臨床使用前，必須對疫苗的安全性進(jìn)行評價。在疫苗臨床前動物安全性評價過程中，根據(jù)對疫苗安全性擔(dān)憂的各個方面，可以將臨床前動物安全性評價概括為幾個主要內(nèi)容: ( 1)急性毒性試驗; ( 2)重復(fù)給藥毒性試驗; ( 3)局部刺激性試驗; ( 4)過敏性試驗; ( 5)生殖毒性試驗。由于疫苗是通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答而并在過程中可能影響動物胚胎以及幼仔發(fā)育［3］，因此在生殖毒性試驗中，需研究疫苗對動物胚胎和幼仔發(fā)育的影響［4］。

本實驗室在前期工作中利用生物信息學(xué)技術(shù)，計算機(jī)模擬得到一系列bFGF及VEGF相關(guān)的表位，并通過linker將優(yōu)勢表位進(jìn)行連接構(gòu)建至pET32a表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)鑒定，并建立起一套純化、免疫小鼠的試驗方法［5］。前期工作也探究了VBP3局部刺激與全身過敏性實驗，并發(fā)現(xiàn)VBP3對家兔皮下注射的局部刺激反應(yīng)輕微;豚鼠實驗亦未見嚴(yán)重的過敏癥狀［6］。本研究初步探討VBP3對小鼠的毒性及對生殖的影響，旨在進(jìn)一步為VBP3作為一種多肽疫苗的臨床前動物安全性評價奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1菌株和動物

VBP3工程菌為本實驗室構(gòu)建; SPF級BALB/c小鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，雌性BALB/c小鼠10只，雄性BALB/c小鼠5只，均為4～6周齡。

2主要試劑和儀器

2.1主要試劑bFGF及VEGF購自Prospec; His Tag鎳離子柱為GE產(chǎn)品;弗氏完全佐劑( FCA)及弗氏不完全佐劑( FICA)購自Sigma;胰蛋白胨和酵母粉購于OXOID; OTC包埋劑購于Tissue-Tek; HE染色試劑購于艾斯金公司; HRP-羊抗鼠抗體購于博奧森公司，其余常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2主要儀器熒光顯微鏡為Olympus產(chǎn)品;冰凍切片機(jī)購自Leica;多功能酶標(biāo)儀購自Bio-Tec。

3試驗方法

3.1VBP3免疫小鼠及效價檢測

3.1.1 VBP3免疫BALB/c小鼠依照參考文獻(xiàn)［7］制備VBP3復(fù)合多肽免疫雌性BALB/c小鼠，每只小鼠皮下多點(diǎn)注射100μg，具體免疫方法參考文獻(xiàn)［8］實施。初次免疫將VBP3蛋白與弗氏完全佐劑1∶1體積比例完全乳化后，腳掌、耳緣后側(cè)及皮下多點(diǎn)注射; 2周后進(jìn)行第2次免疫，將VBP3蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1體積比完全乳化，腳掌、耳緣后側(cè)及皮下多點(diǎn)注射;間隔2周后進(jìn)行第3次免疫，方法同第2次免疫;第3次免疫后10 d尾靜脈取血，分離血清收集抗體，間接ELISA方法檢測抗體的效價。

3.1.2小鼠血清中抗體效價檢測( 1)分別用500 μg/L bFGF或VEGF包被ELISA板，4℃孵育16 h 后PBS-T洗滌3次，每次3 min; ( 2)加入200 μL封閉液(含5%脫脂奶粉的PBS-T溶液) 37℃孵育2 h，PBS-T洗滌3次，每次3 min; ( 3)加入200 μL系列稀釋后的小鼠血清，37℃孵育1 h，PBS-T洗滌3次，每次3 min; ( 4)加入200μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgGⅡ抗( 1∶8 000稀釋) 37℃孵育45 min，PBST洗滌3次，每次3 min; ( 5) TMB避光顯色10 min，2 mol/L硫酸終止顯色，酶標(biāo)儀測定A450值。

3.2檢測指標(biāo)及方法

3.2.1一般情況將免疫及對照組小鼠分別與雄性空白小鼠合籠，7 d后取出雄性小鼠，并實驗期間每隔2 d記錄小鼠的飲水、攝食和死亡情況;分別記錄親本雌性小鼠的體重、F1代小鼠的出生數(shù)、活仔數(shù)及F1代小鼠的體重變化情況等。

3.2.2臟器的稱重實驗結(jié)束后，將小鼠摘眼球取血后，迅速分離并剪取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等臟器，小心去除附著的組織，稱重并進(jìn)行OCT包埋，－80℃凍存。

3.2.3組織切片及HE染色將－80℃凍存的臟器進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為5μm，丙酮固定后進(jìn)行蘇木精液染色、1%鹽酸乙醇處理，水返藍(lán)后進(jìn)行0.5%曙紅液染色，最后通過梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹膠封片風(fēng)干后即可在顯微鏡下觀察。

4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，差異顯著性檢驗采用t檢驗。對不同時間各組小鼠的體重數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1免疫小鼠及F1代小鼠效價檢測

間接ELISA檢測抗bFGF抗體效價為1∶20 000，抗VEGF抗體效價為1∶3 000，見圖1。免疫組F1代小鼠血清中的抗VEGF抗體效價與對照組相比無明顯差異，但免疫組F1代小鼠血清相對對照組能檢出低滴度抗bFGF抗體，見圖2。

Figure 1.The antibody titer of serum in parent mice.Mean±SD.n =3.圖1　親本小鼠血清中抗體效價的檢測

Figure 2.The antibody titer of serum in F1 mice.Mean±SD.n =5.圖2　F1代小鼠血清中抗體效價的檢測

2　F1代小鼠存活率

免疫組共產(chǎn)崽35只，平均產(chǎn)崽數(shù)為7只，共存活19只，存活率為54. 28%;對照組小鼠共產(chǎn)崽26只，平均產(chǎn)崽6.5只，共存活25只，存活率為96. 15%，明顯高于免疫組( P＜0. 05)。

3　親本及F1代小鼠體重及臟器比較

免疫組親本小鼠的體重變化趨勢大致與對照組相同，2組之間無明顯差異;在F1代小鼠中，2個組別小鼠體重變化趨勢基本一致，無明顯差異，見圖3;在親本小鼠各臟器重量的比較中，與對照組相比，免疫組小鼠的各臟器重量并無明顯區(qū)別;但對F1代小鼠各個主要臟器重量的比較發(fā)現(xiàn)，免疫組F1代小鼠肝臟重量與對照組有差異，而2個組別的小鼠在脾臟、腎臟、肺臟及心臟的重量比較均未有明顯差異，見圖4。

Figure 3.The body weight of the mice.Mean±SD.n =5～10.圖3　小鼠體重的監(jiān)測

Figure 4.The organ weight of the mice.Mean±SD.n =5.*P＜0. 05 vs control.圖4　小鼠各臟器重量結(jié)果

Figure 5.HE staining of organs from parent mice(×400).圖5　親本小鼠各臟器HE染色

4　各臟器的HE染色

親本小鼠中，2個組別小鼠臟器的HE染色比較中，未有明顯的形態(tài)差異，見圖5;在F1代小鼠中，免疫組小鼠的肝臟細(xì)胞形態(tài)與對照組相比有差異，在其它的臟器HE染色比較中，2個組別的小鼠則未有明顯的形態(tài)差異，見圖6。

討論

VBP3是通過將bFGF和VEGF的多個抗原表位通過Linker串聯(lián)，在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得。在小鼠實驗中，該多肽疫苗能夠在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗bFGF及VEGF的高滴度抗體，并在小鼠黑色素瘤模型中發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合多肽疫苗能夠能抑制腫瘤生長及血管新生［5］。然而，VBP3復(fù)合多肽疫苗在用于人體之前，其安全性是必須首先考慮的一個方面。實驗室前期工作中完成了常規(guī)豚鼠主動過敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VBP3幾乎無致敏性，且高劑量的豚鼠均未出現(xiàn)不良或過敏癥狀［6］。

由于疫苗本身并不直接發(fā)揮預(yù)防或治療的作用，而是通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體或活化T細(xì)胞發(fā)揮作用，因此，疫苗的安全性尤其重要。本研究顯示在免疫雌性BALB/c小鼠過程中，免疫組與對照組親本小鼠生長情況基本一致，無明顯差異。在重要器官重量的比較中，2組小鼠亦無明顯差異;在HE染色比較中，免疫組與對照組親本小鼠在各個器官的HE染色則無明顯形態(tài)差異，結(jié)果表明在該實驗條件下，VBP3對親本小鼠的心臟、脾臟、肝臟、腎臟及肺等器官無明顯毒性作用。

Figure 6.HE staining of organs from F1 mice(×400).圖6　F1代小鼠各臟器HE染色

在藥物非臨床安全性評價中，發(fā)育和生殖毒性評價是重要組成部分。其中，發(fā)育主要包括胚胎的發(fā)育、胎仔的發(fā)育及出生幼仔的發(fā)育過程，藥物發(fā)育毒性評價是指藥物對在這一系列的發(fā)育過程中產(chǎn)生的損害作用進(jìn)行評價［9］。親本雌性小鼠與健康雄性小鼠交配后，在小鼠生產(chǎn)數(shù)目的比較中，免疫組與對照組未有明顯差異存在，但在崽鼠存活率比較中，免疫組幼鼠存活率為54.28%，相對對照組(存活率94.15%)有差異。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，靶向VEGF、bFGF抗體均可抑制血管的新生［10-11］，在小鼠胚胎發(fā)育過程中需要新生血管供給，而血管網(wǎng)絡(luò)的建成需要VEGF、bFGF等細(xì)胞因子促趨化血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成血管［12］。我們推斷，VBP3免疫小鼠后所產(chǎn)生的抗體可能會中和bFGF和VEGF的作用，進(jìn)而抑制或延緩小鼠胚胎發(fā)育過程中的血管的新生，影響小鼠胚胎的發(fā)育，從而導(dǎo)致免疫組F1幼鼠的存活率的降低，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。在對F1代小鼠的檢測指標(biāo)監(jiān)測中，其體重變化趨勢、基本一致，未有明顯差異。在各臟器的HE染色中，免疫組與對照組中的心臟、脾臟和腎臟中未有明顯的形態(tài)變化，但在肝臟的比較中發(fā)現(xiàn)，在F1代小鼠的肝臟HE染色比較中，免疫組F1代小鼠的肝臟細(xì)胞間間隔較大，部分細(xì)胞呈彌散形，且存在較多空泡狀的細(xì)胞。

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Effect of VEGF/bFGF complex peptide vaccine on toxicity and reproductivity in female-mice

WENG Rui-qiang，PAN Lei，PENG Hui-tong，LU Cheng-ding，DENG Ning
( Antibody Engineering Center，Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tdengn@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the toxicity and reproductive effect of vascular endothelial growth factor ( VEGF) /basic fibroblast growth factor ( bFGF) complex peptide vaccine ( VBP3) on the female-mice.METHODS: The VBP3 was purified with Ni-NTA affinity chromatography.The female BALB/c mice were immunized with the purified VBP3.The antibody titer in the serum was detected by ELISA.The data of the body weight and the organ weight of the parent mice were gathered and analyzed，and the pathological changes of the organs were observed with HE staining to investigate the toxicity of VBP3.To investigate the toxicity of VBP3 in the F1 mice，the parent immunized female mice were mated with the parent non-immunized male mice.After the F1 mice were born，the survival rate was calculated，the change of the body weight and the organ weight of the F1 mice were also determined.The pathological changes of the organs in F1 mice were also observed with HE staining.RESULTS: In the parent mice，high titers of the antibodies were detected against VEGF and bFGF，and no difference of the body weight，the organ weight and the pathological change between the immunized mice and control mice was found.In the F1 mice，a low titer of anti-bFGF antibody was detected compared with blank group.The survival rate in control group was higher than that in immunized group.In the 2 groups of the F1 mice，no obvious difference of the weight of the spleen，kidney，lung and heart was observed，and there was some difference in the weight of liver between the 2 groups.The results of the HE staining in the F1 mice showed some difference in the liver between the 2 groups.CONCLUSION: VEGF/bFGF complex peptide vaccine has no obvious organ toxicity in the parent female mice，but has some side effects on the reproductive and the healthy processes of F1 mice.

［KEY WORDS］Vascular endothelial growth factor; Basic fibroblast growth factor; Peptide vaccine

通訊作者△Tel: 020-85223259; E-mail: tdengn@ jnu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目( No.81372281) ;深圳市科技計劃項目( No.JCYJ20140416085544636)

［收稿日期］2015-03-02［修回日期］2015-05-15

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1184-05

［中圖分類號］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.006