張 凱，雷振山，王亞莉

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽(yáng)464000)

種子的萌發(fā)是作物生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，種子發(fā)芽時(shí)期和質(zhì)量好壞直接影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)效益。在以往的研究中，如何促進(jìn)種子的萌發(fā)一直是人們關(guān)注的主要話題，但是，抑制種子的萌發(fā)同樣具有實(shí)用價(jià)值和研究意義。例如，水稻在收獲前如遇高溫多濕天氣，往往發(fā)生穗上萌發(fā)［1］，這不僅造成水稻產(chǎn)量下降，同時(shí)還影響種子質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益，因此，如何防止種子穗上萌發(fā)已是雜交水稻生產(chǎn)實(shí)際中亟需解決的問題。種子的萌發(fā)受許多因素的影響，包括環(huán)境因子、激素水平、種子活力等［2］，其中，激素對(duì)種子萌發(fā)的影響一直是研究熱點(diǎn)。ABA通常被認(rèn)為是抑制型植物激素，與植株衰老和器官(葉、蕾、鈴)脫落有密切聯(lián)系［3］。但近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，ABA對(duì)大豆和水稻等作物子粒的休眠和萌發(fā)具有調(diào)控作用［4－5］，GA可以促進(jìn)基因表達(dá)，增加植物種子水解酶的合成而促進(jìn)種子萌發(fā)。已有研究表明，內(nèi)源ABA可通過抑制水解酶的含量而誘導(dǎo)種子休眠［6］。miRNA是一類長(zhǎng)21～25 bp具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA。研究表明，OsmiR156能夠負(fù)調(diào)控水稻種子的產(chǎn)量和穗分枝數(shù)［7－8］。與其相反，OsmiR397正調(diào)控種子的發(fā)育，研究顯示，過表達(dá)OsmiR397能夠增大水稻種子的體積，進(jìn)而提高水稻的產(chǎn)量［9］。在擬南芥中，ABA通過誘導(dǎo)與擬南芥種子發(fā)育相關(guān)miR159的表達(dá)，抑制miR159兩個(gè)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響擬南芥種子的萌發(fā)［10］。同樣作為模式植物的水稻，其種子的發(fā)育同樣受到miRNA的精細(xì)調(diào)控［10－12］，且已有水稻種子發(fā)育相關(guān)的miRNA被分離和鑒定;但尚未有關(guān)于ABA對(duì)種子發(fā)育相關(guān)的miRNA表達(dá)量的影響及其調(diào)控種子活力、影響種子萌發(fā)的研究報(bào)道。為此，本研究分析了外源施加不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)于水稻種子萌發(fā)、內(nèi)源ABA含量和內(nèi)源GA含量和與種子發(fā)育相關(guān)的OsmiR156和OsmiR397表達(dá)量的影響，旨在進(jìn)一步揭示ABA對(duì)水稻種子萌發(fā)的生理和分子效應(yīng)，為深入認(rèn)識(shí)種子萌發(fā)的分子調(diào)控機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集河南省2014年大田種植的由信陽(yáng)市農(nóng)科所通過培矮64 S×豫粳3號(hào)雜交培育而成的粳稻品種兩優(yōu)信粳1號(hào)種子，4℃儲(chǔ)藏備用。試劑ABA購(gòu)至sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)活力測(cè)定 選取健康飽滿的水稻種子經(jīng)0.5%NaClO消毒25 min后，反復(fù)沖洗干凈。用不同質(zhì)量濃度 (0，10，20，40，80 mg·L－1)ABA浸種24 h，浸后的種子用清水沖洗干凈，然后于30℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)6 d。第2天開始發(fā)芽計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)把發(fā)芽合格的種子從發(fā)芽床中揀出，記錄每天揀出種子數(shù)，即為新發(fā)芽種子數(shù)，直至6 d。分別在第3天的統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽勢(shì)，在第6天用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量根和地上部分的長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)［13］。種子以100粒為1重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.2 通過采用高效液相色譜法測(cè)定種子內(nèi)源ABA和GA質(zhì)量濃度 樣品提取:稱取1.0 g左右經(jīng)ABA浸種24 h后水稻種子，液氮研磨，加入含有5 mL銅試劑(30 mg·L－1)的冷乙腈，在4℃冰箱中提取 12 h，5 000 r·min－1離心 15 min，取上清液。再重復(fù)提取2次，最后合并上清液。在37～40℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直干，用2 mL三氯甲烷和0.4 mol·L－1磷酸緩沖液 2 mL，以去除色素，重復(fù)3次，合并溶液，取上清液，加入150 mg聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)除去酯類，10 000 r·min－1離心 15 min，然后在 37 ～40 ℃ 條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直干，用1 mL流動(dòng)相［V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(0.6%乙酸)=50∶45∶5］溶解，用孔徑為0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾，上機(jī)分析。所用分析柱為 Symmetry C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相流速0.4 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.3 種子miRNA含量提取及表達(dá)量檢測(cè) 總RNA提取:稱取1.0 g左右經(jīng)不同質(zhì)量濃度ABA浸種24 h后水稻種子，液氮研磨，裝入1.5 mL EP管中;然后參照TAKARA公司RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)說明提取水稻種子總RNA。

cDNA的合成:取1μg總 RNA，按照 TaKARA公司One Step PrimeScript MiRNA cDNA Synthesis Kit說明進(jìn)行cDNA第1條鏈的合成。cDNA合成后先通過普通PCR進(jìn)行檢驗(yàn)?zāi)孓D(zhuǎn)錄是否成功，然后把剩余cDNA存放于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

半定量RT-PCR驗(yàn)證OsmiR156和OsmiR397的表達(dá)量變化:為了準(zhǔn)確檢測(cè) OsmiR156和OsmiR397的表達(dá)量，以水稻U6做為內(nèi)參照基因，對(duì)不同的模板樣品進(jìn)行均一化處理。然后對(duì)各樣品中OsmiR156和OsmiR397進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。引物 采 用 前 人 研 究 報(bào) 道 的 OsmiR156［8］和OsmiR397［9］正向引物，引物序列如下:U6正向引物:5'-CGATAAAATTGGAACGATACAGA-3';反向引物:5'-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3';OsmiR397正向引物:5'-GTTCATCAACGCTGCACTCAA-3'，OsmiR156 正向引物:GTGCTCACTCTCTTCTGTCA，反向引物由試劑盒提供。反應(yīng)程序如下:94℃ 預(yù)變性1 min，94℃ 變性30 s，55℃退火30 s，7 2 ℃ 延伸 30 s，72 ℃ 延伸 10 min。取 1 μL轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用1%膠檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ABA對(duì)水稻種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

圖1 不同質(zhì)量濃度ABA處理對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of treatment with different concentrations of ABA on the vigor of rice seeds

經(jīng)外源ABA浸泡處理后，水稻種子的發(fā)芽勢(shì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)有明顯影響(圖1)。質(zhì)量濃度10 mg·L－1的ABA處理種子的發(fā)芽勢(shì)比對(duì)照顯著提高了6.2%;發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率分別比對(duì)照提高了5.8%和6.5%，而且種子的活力指數(shù)也提高7.1%，與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平。然而隨著ABA質(zhì)量濃度的提高，水稻種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯下降，并且與CK差異達(dá)極顯著水平。同時(shí)各處理間處理質(zhì)量濃度越高，發(fā)芽勢(shì)越低，抑制萌發(fā)效果越好。尤其當(dāng)ABA質(zhì)量濃度達(dá)到40 mg·L－1與低于該質(zhì)量濃度的各處理(包括 CK)差異達(dá)極顯著水平，而與80 mg·L－1處理差異不顯著，發(fā)芽率和種子活力分別降低到78.5%和67.7%，結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度ABA處理對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度促進(jìn)發(fā)芽，高質(zhì)量濃度抑制發(fā)芽。

2.2 外源ABA對(duì)水稻種子內(nèi)源ABA和GA質(zhì)量濃度的影響

水稻種子經(jīng)不同質(zhì)量濃度外源ABA浸泡處理后，內(nèi)源ABA和GA含量出現(xiàn)明顯變化。表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度處理使種子內(nèi)源ABA降低，高質(zhì)量濃度處理使種子內(nèi)源ABA含量升高，而GA表現(xiàn)為相反的趨勢(shì)。結(jié)果如圖2所示，外源ABA質(zhì)量濃度低于20 mg·L－1時(shí)，內(nèi)源ABA含量與CK相比顯著降低，并隨質(zhì)量濃度提高而降低;但當(dāng)外源ABA質(zhì)量濃度高于20 mg·L－1時(shí)，內(nèi)源ABA含量與對(duì)CK比顯著增加。增加幅度最大為40 mg·L－1，比CK增加1.78倍，并且與CK差異達(dá)極顯著水平。當(dāng)外源ABA質(zhì)量濃度進(jìn)一步提高達(dá)到80 mg·L－1時(shí)，內(nèi)源 ABA的增加趨勢(shì)則不明顯。對(duì)于內(nèi)源GA來說，各處理的GA含量均顯著降低。與CK相比，質(zhì)量濃度10 mg·L－1降低幅度最小，質(zhì)量濃度80 mg·L－1降低幅度最大。進(jìn)一步分析內(nèi)源ABA與GA含量的比值發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度的ABA處理以后，各處理水稻種子內(nèi)源ABA/GA的值均高于CK。而且隨著外源ABA質(zhì)量濃度的提高，這個(gè)比值逐漸提高。與CK相比，質(zhì)量濃度10 mg·L－1增加幅度較小，為2.43倍，而質(zhì)量濃度80 mg·L－1增幅達(dá)到CK的21.84倍(圖3)。

圖2 不同質(zhì)量濃度ABA處理對(duì)水稻種子ABA和GA含量的影響Fig.2 Effects of treatment with different concentrations of ABA on the levels of GA and ABA in rice seeds

圖3 不同質(zhì)量濃度外源ABA處理后水稻種子內(nèi)源ABA/GA值Fig.3 Effects of treatment with different concentrations of ABA on the levels of ABA/GA in rice seeds

2.3 不同質(zhì)量濃度外源ABA處理對(duì)水稻種子中OSmiR156和OSmiR397表達(dá)量的影響

RT-PCR如圖4結(jié)果所示，水稻種子經(jīng)10 mg·L－1的ABA浸泡處理后，促進(jìn)種子發(fā)育的OSmiR397的表達(dá)量明顯較對(duì)照升高，表明質(zhì)量濃度10 mg·L－1ABA浸泡提高了水稻種子的活力，增強(qiáng)種子萌發(fā)的潛力。這與質(zhì)量濃度10 mg·L－1ABA處理促進(jìn)種子萌發(fā)的結(jié)果相印證，并為其提供了分子水平的證據(jù)。但當(dāng)外源ABA質(zhì)量濃度高于40 mg·L－1時(shí)，OSmiR397的表達(dá)量較對(duì)照相比下降了，而且隨著 ABA質(zhì)量濃度的升高，OSmiR397的表達(dá)量隨之下降，尤其當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到80 mg·L－1時(shí)，OSmiR397的表達(dá)量幾乎檢測(cè)不到。另一方面，ABA對(duì)于OSmiR156的表達(dá)有明顯抑制作用，且隨著外源ABA質(zhì)量濃度的提高，抑制作用越明顯。這表明ABA對(duì)于調(diào)控OSmiR156和OSmiR397表達(dá)呈現(xiàn)不同的機(jī)制。

圖4 RT-PCR分析不同質(zhì)量濃度ABA處理對(duì)水稻種子OSmiR156和OSmiR397表達(dá)量的影響Fig.4 RT-PCR analysis the effects of treatment with different concentrations of ABA on the expression levels OSmiR156 and OSmiR397 on t in rice seeds

3 討論

除了環(huán)境因子對(duì)種子的萌發(fā)就有顯著影響外，植物激素對(duì)種子萌發(fā)的影響也十分劇烈［2，10］。作為一種重要的植物激素，ABA對(duì)調(diào)節(jié)水稻種子的萌發(fā)起著重要的作用。已有的研究表明，GA則可誘導(dǎo)產(chǎn)生或激活α－淀粉酶等水解酶而促進(jìn)種子的萌發(fā)，ABA可以調(diào)節(jié)或抑制一些水解酶的活性而有利于淀粉和蛋白質(zhì)的合成和積累而不利于種子的萌發(fā)［14，15］。黃宇等［16］認(rèn)為，一定質(zhì)量濃度的ABA對(duì)于水稻種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。徐福樂等認(rèn)為，一定質(zhì)量濃度ABA浸種能夠延緩或抑制作物種子的萌發(fā)進(jìn)程，但不影響作物種子的最終萌發(fā)率，而低質(zhì)量濃度ABA可以促進(jìn)種子萌發(fā)，促進(jìn)幼苗根的伸長(zhǎng)，增加根鮮質(zhì)量和根葉比［17］。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)外源ABA處理后，在小于等于10 mg·L－1的低質(zhì)量濃度下ABA促進(jìn)種子的萌發(fā)，這與前人的研究結(jié)果相一致。而大于或等于20 mg·L－1質(zhì)量濃度下，種子的萌發(fā)率明顯降低。并且一定范圍內(nèi)質(zhì)量濃度越大，降低越明顯。而且分析與種子萌發(fā)密切相關(guān)的內(nèi)源激素ABA和GA發(fā)現(xiàn)，外源ABA處理對(duì)于種子內(nèi)源激素影響也很明顯，尤其會(huì)導(dǎo)致ABA/GA的比值升高，一定范圍質(zhì)量濃度越高，升高幅度越明顯。而已有的研究證明ABA/GA 比值高則不利于種子萌發(fā)［15－17］，進(jìn)一步檢測(cè)與種子發(fā)育相關(guān)的miRNA表達(dá)量的變化發(fā)現(xiàn)，低于等于20 mg·L－1質(zhì)量濃度外源ABA處理能夠提高與種子發(fā)育正相關(guān)OSmiR397的表達(dá)，預(yù)示著種子活力的提高，反之，高于20 mg·L－1質(zhì)量濃度能夠抑制其表達(dá)，表明種子活力降低。這也與萌發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果相一致。而OSmiR156的表達(dá)在ABA處理后一直呈下降趨勢(shì)。表明與OSmiR397響應(yīng)ABA調(diào)控的模式不完全一致，ABA負(fù)調(diào)控OSmiR156的表達(dá)。這種負(fù)調(diào)控模式與擬南芥中ABA誘導(dǎo)miR159的表達(dá)模式相反［8］。

綜上所述，外源ABA噴施在水稻的生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。外源施加低質(zhì)量濃度的ABA能夠很好促進(jìn)種子的萌發(fā)，提高成苗率;外源施加高質(zhì)量濃度的ABA能夠顯著降低種子的萌發(fā)，這可能很好地解決水稻穗上萌發(fā)等問題。所以，進(jìn)一步地做好ABA試驗(yàn)、推廣、應(yīng)用工作對(duì)于提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。

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