蔣素華，李艷輝，王潔瓊，梁 芳，王默霏，崔 波

(1.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所，河南 鄭州450044;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002;3.封丘縣農(nóng)業(yè)局，河南 新鄉(xiāng)453300)

萼脊蘭(Sedirea japonica)是蘭科(Orchidaceae)萼脊蘭屬(Sedirea)植物，主要產(chǎn)于中國(guó)浙江(文成)、云南西部(盈江)，生長(zhǎng)于海拔600～135 0 m的疏林樹(shù)干上或山谷巖壁上，在日本(琉球群島)、朝鮮半島南部也有少見(jiàn)，是一種觀賞價(jià)值很高的附生蘭，因其花小而素雅，其花色清麗，具有奇妙的幽香，觀賞期長(zhǎng)，養(yǎng)護(hù)簡(jiǎn)單且耐寒，故越來(lái)越受到人們的親睞［1－3］。隨著分子生物學(xué)在花卉相關(guān)研究及其在育種過(guò)程中的應(yīng)用，近幾年來(lái)蘭科植物相關(guān)基因成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，對(duì)萼脊蘭相關(guān)基因的研究也是剛剛起步［4－6］。本試驗(yàn)采用Trizol法、CTAB法、RNA prep Pure Plant Kit方法分別從萼脊蘭的根、葉、花葶、花萼、花瓣、柱頭、唇瓣中提取總RNA，比較3種總RNA提取方法的優(yōu)劣，分析所提萼脊蘭不同組織總RNA的質(zhì)量高低。RNA分離提取是分子生物學(xué)研究的基本內(nèi)容，也是功能基因組學(xué)研究技術(shù)的重要基礎(chǔ)。因此，萼脊蘭不同組織總RNA提取和質(zhì)量的研究對(duì)于萼脊蘭基因克隆、定量PCR、Northern雜交分析、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建等提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

以鄭州師范學(xué)院蘭花工程技術(shù)研究中心溫室的萼脊蘭為試材。將盛花期新鮮的萼脊蘭根、葉、花葶、花萼、花瓣、唇瓣、柱頭用剪刀取下，迅速放入液氮中速凍，然后放于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 玻璃器皿及研缽的處理

普通玻璃、金屬藥匙和研缽于200℃烘烤8 h。用于RNA電泳的電泳槽先用去污劑洗干凈，雙蒸水沖洗3～4遍，自然干燥后，用滅菌的 0.1%DEPC浸泡24 h。塑料制品等用 0.1%DEPC水37℃浸泡過(guò)夜后高壓滅菌。

1.3 試劑

CTAB提取 RNA緩沖液為:2%CTAB，2%PVP，25 mmol·L－1EDTA，100 mmol·L－1Tris-Cl pH 值 8.0，2.0 mol·L－1NaCl，0.5 g·L－1Spermidine(亞精胺)。滅菌后加入體積分?jǐn)?shù)2%β-巰基乙醇。

SSTE buffer 為:1.0 mol· L－1NaCl，0.5%SDS，10 mol·L－1Tris-Cl pH 值 8.0，1.0 mol·L－1EDTA。

V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，將氯仿和異戊醇按體積24∶1的比例混勻，置棕色瓶中，4℃保存。

V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，飽和酚、氯仿、異戊醇體積比為25∶24∶1混勻，置棕色瓶中，4℃保存。

DEPC(焦碳酸二乙酯)、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、EDTA(乙二胺四乙酸)、Tris、冰醋酸、PVP、Na-CI、CTAB、NaAc、LiCl。

1.4 儀器

－80℃超低溫冰箱、鼓風(fēng)干燥箱、Quawell Q5000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(200～850 nm全波長(zhǎng)掃描核算蛋白測(cè)定儀)、電泳儀及電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、高速冷凍離心機(jī)、實(shí)施熒光定量PCR儀、旋渦混合器。

1.5 方法

1.5.1 CTAB法 65°C水浴中預(yù)熱30 mL CTAB提取液。液氮中研磨0.5 g冷凍的材料。轉(zhuǎn)移樣品至有 CTAB提取液的離心管中，立即激烈渦旋30 s，短時(shí)放回65°C水浴中4～5 min。加入等體積的氯仿/異戊醇并渦旋混合，4℃下12 000 r·min－1離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至一新離心管。重復(fù)抽提1次。將上清轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，加入 8 mol·L－1LiCl，使 LiCl的終濃度為2 mol·L－1，4℃下沉淀過(guò)夜。4℃離心1 h，棄上清液，用500 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗沉淀，然后用500 μL無(wú)水乙醇洗沉淀。用500 μL SSTE溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇抽提1次。加入2倍體積的冰浴無(wú)水乙醇，在－80℃沉淀30 min。4℃離心20 min沉淀RNA。先用400 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗沉淀，然后用400 μL無(wú)水乙醇洗沉淀，吹干后加入65 μL DEPC水溶解RNA。

用DNase處理提取的 RNA:用65 μLDEPC水溶解 RNA沉淀，加入10×DNase assay buffer 7.5 μL ，RNase inhibitor 1.0 μL，DNaseⅠ1.5 μL 37 ℃水浴20 min，調(diào)整樣品體積至250 μL，加入1/10體積 3 mol·L－1NaAc(pH=5.2)，即 25 μL，渦旋混勻。加入2倍體積冷的無(wú)水乙醇，混勻后，儲(chǔ)存在－20℃ 30 min。4℃離心20 min，沉淀 RNA(全速)，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗沉淀，然后用無(wú)水乙醇洗沉淀，吹干后，用適量DEPC水溶解RNA。置－80℃冰箱中保存。

1.5.2 Trizol法 參照 invitrogen Trizol試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.3 RNA prep Pure Plant Kit法 參考天根科技有限公司RNA prep Pure Plant Kit提取說(shuō)明書方法。

1.5.4 完整性檢測(cè) 取2 μLRNA 樣品在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)總 RNA的28S、18S和5S。

1.5.5 總RNA的濃度及純度測(cè)定 利用Quawell Q5000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的A260/A280的值和A26 0/A230的值，同時(shí)測(cè)定其濃度。

1.5.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)檢測(cè)qRT-PCR對(duì)cDNA的純度和質(zhì)量都有較高的要求，為了驗(yàn)證不同組織總RNA的可用性效果，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。

分別提取萼脊蘭不同組織的總 RNA，使用TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit With gDNA E-raser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以內(nèi)參基因 18S-F:5’GAACGAGACCTCAGCCTGCTA3’和18S－R:5’CATCACGGACCTGTTATTGC3’為引物，對(duì)所得的cDNA進(jìn)行表達(dá)分析。采用三步法qRT-PCR，20 μL 反應(yīng)體系包括 10 μL 2 × SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)、0.8 μL 的上下游基因特異性引物及各個(gè)樣本的 cDNA2.0 μL，并補(bǔ)dH2O至20 mL。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95℃ 30 s;95℃變性15 s;退火15 s;72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA完整性檢測(cè)

分別將3種方法提取的萼脊蘭7個(gè)不同組織的總RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1)，結(jié)果顯示 CTAB法提取的 RNA 28S、18S、5S條帶清晰，表明所提取的總RNA基本沒(méi)有降解。Trizol法提取的RNA 28S、18S、5S條帶3個(gè)組織中的條帶較清晰，其余4個(gè)組織中的總RNA條帶亮度較差。RNA prep Pure Plant Kit提取的 RNA根、花萼、花瓣28S、18S條帶較清晰，其余組織中的28S、18S、5S不清晰，RNA質(zhì)量很差。

2.2 樣品的濃度與純度

高純度 RNA 的 OD260/OD280應(yīng)介于 1.8 ～2.0，OD260/OD230應(yīng)大于2.0，CTAB法提取的7個(gè)組織的總 RNA OD260/OD280介于1.8 ～2.0，說(shuō)明樣品未受污染，RNA較純;RNA的質(zhì)量濃度在200～500 g·L－1;Trizol法提取的不同組織的總RNA的純度和濃度只有葉、花葶、花萼、唇瓣OD260/OD280介于1.8～2.0，說(shuō)明 RNA 較純，其余的組織 OD260/OD280在1.8以下，表明有蛋白質(zhì)、多糖或多酚殘留，RNA 的質(zhì)量濃度在 50～300 g·L－1。RNA prep Pure Plant Kit提取的RNA只有根、花萼、花瓣OD260/OD280介于 1.8 ～2.0，其余 4 個(gè)組織的總RNA OD260/OD280均低于 1.8，RNA 的質(zhì)量濃度在50～100 g·L－1。3種方法提取的總 RNA的OD260/OD230都低于2.0，說(shuō)明RNA被碳水化合物，鹽類或有機(jī)溶劑污染?？梢?jiàn)CTAB法提取的總RNA質(zhì)量?jī)?yōu)與Trizol法和RNA prep Pure Plant Kit。

圖1 CTAB法、Trizol法、RNA prep Pure Plant Kit提取總RNAFig.1 Total RNA was extracted with CTAB method，Trizol method and RNA prep Pure Plant extract Kit

2.3 不同組織總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

為進(jìn)一步確定利用CTAB法提取的不同組織總RNA的質(zhì)量高低，對(duì)提取的總RNA分別做熒光定量PCR，擴(kuò)增內(nèi)參基因18S。由擴(kuò)增曲線(圖2)可知，擴(kuò)增曲線平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近;由溶解曲線(圖3)可知，TM值在80～90℃，說(shuō)明無(wú)引物二聚體存在，溶解曲線為單一峰，并且波峰位置重疊，說(shuō)明沒(méi)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。本試驗(yàn)將內(nèi)參基因18S的熒光定量PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖4)，18S條帶亮且單一，不含引物二聚體，說(shuō)明利用CTAB法提取的不同組織的總RNA完全可以滿足熒光定量PCR的要求，為下一步目的基因的表達(dá)分析奠定了良好基礎(chǔ)。

圖2 18S基因擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curve of 18S gene

3 討論

圖3 18S基因溶解曲線Fig.3 Melting curve of 18S gene

圖4 18S基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增Fig.4 Real time PCR of 18S gene

植物組織總RNA的提取是分子生物學(xué)研究中的基礎(chǔ)，更是研究中的難點(diǎn)。不同的植物種類，甚至同一種植物不同組織、不同時(shí)間的同一組織材料都會(huì)因?yàn)槠渲谢瘜W(xué)組成的不同而需要對(duì)其總RNA提取的方法做出相應(yīng)調(diào)整［7－10］。Trizol法步驟繁瑣，試劑配制麻煩，在提取過(guò)程中RNA容易丟失而影響RNA的濃度;針對(duì)植物多糖、多酚RNA prep Pure Plant Kit試劑盒法的適用性雖較為普遍，操作簡(jiǎn)單，但是成本高，RNA得率低。CTAB法提取過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，但是操作步驟靈活，提取的RNA濃度高，適合萼脊蘭不同組織總RNA的提取。

萼脊蘭不同組織中的總RNA的提取過(guò)程中，利用CTAB法，萼脊蘭根、花瓣、花葶、花萼、唇瓣、柱頭較好提取，提取過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)粘稠狀的物質(zhì)，而在葉片中出現(xiàn)粘稠狀物質(zhì)，這可能是因?yàn)椴煌l(fā)育時(shí)期糖分代謝不同［11］，趙春喜等［12］也認(rèn)為植物成熟組織常富含多糖;而多糖的許多理化性質(zhì)又與RNA相似，在提取中與RNA以復(fù)合體形式存在，增大了提取難度。在溶解RNA時(shí)，該復(fù)合體難溶于水，因而出現(xiàn)溶解后呈黏稠狀的膠質(zhì)溶液［13－14］。

對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)常使用β-肌動(dòng)蛋白基因、28S和18S rRNA等看家基因作為內(nèi)部參照，這些基因被認(rèn)為在某些類型細(xì)胞中的表達(dá)是恒定的［15－16］。本試驗(yàn)采用內(nèi)參基因18S進(jìn)行QRTPCR檢測(cè)RNA質(zhì)量，為基因表達(dá)分析奠定了基礎(chǔ)。

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