施會(huì)敏，張 俊，何燕芳，張愛青，甘衛(wèi)華

0 引 言

系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞的重要組成成分，正常情況下，其數(shù)量、形態(tài)和位置均保持相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)維持腎正常的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著重要作用。但在許多慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)中常伴有腎小球系膜細(xì)胞的損傷，系膜細(xì)胞凋亡是多種腎疾病的共同組織病理學(xué)改變，研究表明，系膜細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致大鼠蛋白尿的發(fā)生，凋亡程度與其嚴(yán)重程度密切相關(guān)［1］。近年研究表明腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在CKD 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。醛固酮作為RAAS 系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，除了其血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)致水鈉潴留以外，其余多種途徑亦可導(dǎo)致腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，并可造成腎小球系膜細(xì)胞及足細(xì)胞的損害［2-5］，導(dǎo)致蛋白尿，介導(dǎo)CKD 的進(jìn)展及惡化，但其致腎損傷的具體機(jī)制目前尚不明確。因此，本研究擬探討醛固酮是否可通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因P53、Bcl-2 和C-myc 從而引起大鼠系膜細(xì)胞凋亡，旨在為臨床應(yīng)用醛固酮受體拮抗劑治療相關(guān)腎病提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器 正常大鼠腎小球系膜細(xì)胞株(中國典型培養(yǎng)物保藏中心;胎牛血清(Gibco，美國);0.25%含EDTA 的胰蛋白酶(Gibco，美國);DMEM 培養(yǎng)液(Gibco，美國);醛固酮(Sigma，美國);Trizol(Invitrogen，美國);總RNA 提取試劑盒(TIANGEN，德國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，加拿大);SYBR PCR Mix(Life，美國);倒置顯微鏡(Olympus，日本);流式細(xì)胞儀(BD，法國);PCR 儀(Life，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 天換液，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)用0.25%的胰酶消化傳代，取第4 ～6 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長期的系膜細(xì)胞用胰酶消化后，以2×105個(gè)/孔密度接種于6 孔板培養(yǎng)。本研究以10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L 醛固酮分別作用系膜細(xì)胞24 h 后，棄上清，用胰蛋白酶洗脫細(xì)胞，取0.1 mL 所得細(xì)胞懸液，加入0.1 mL 0.3%錐蟲藍(lán)及0.8 mL D-Hanks 液混合均勻，計(jì)算活細(xì)胞比率。相差顯微鏡下，死亡細(xì)胞著色，活細(xì)胞透明狀。公式如下:

活細(xì)胞比率=［活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))］×100%

根據(jù)公式得出10-7、10-6、10-5mol/L 醛固酮作用系膜細(xì)胞活力均在90%以上，提示這3 種濃度無明顯毒性作用，本研究選用10-6mol/L 醛固酮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Annexin V/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡根據(jù)Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說明操作。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后，以2×105個(gè)/孔密度接種于6 孔板培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)換用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長同步化。實(shí)驗(yàn)分組如下:對(duì)照組;醛固酮組:培養(yǎng)液+醛固酮(10-6mol/L)。24 h 后胰酶消化后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次并離心，100 μL 預(yù)冷binding buffer 重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin v-FITC 和5 μL PI 混勻，避光室溫反應(yīng)10 min，加人400 μL binding buffer 終止反應(yīng)，篩網(wǎng)過濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。BD Accuri C6軟件分析細(xì)胞凋亡。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)P53、Bcl-2、C-myc mRNA 的表達(dá)細(xì)胞生長同步化后，根據(jù)不同分組處理細(xì)胞。24 h 后收集細(xì)胞，每組均設(shè)6 個(gè)重復(fù)。用Trizol 按TIANGEN 總RNA 提取試劑盒說明書操作。用核酸分析儀測(cè)定所提取RNA 的濃度和純度。取1 μg 總RNA 配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按試劑盒說明合成cDNA，反應(yīng)條件:25 ℃5 min，45 ℃60 min，70 ℃5 min。以此為模板用P53、Bcl-2、C-myc 和GAPDH 引物經(jīng)熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。引物使用Premier 3.0 軟件輔助自行設(shè)計(jì)，所有引物由Invitrogen公司上海合成部合成，引物序列如下:大鼠GAPDH sense:5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3'，GAPDH antisense:5'-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3'(149 bp);大鼠P53 sence:5'-TCTCCCCAGCAAAAGAAAAA-3'，P53 antisense:5'-CTTCGGGTAGCTGGAGTGAG-3'(168 bp);大鼠Bcl-2 sense:5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3'，Bcl-2 antisense:5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3'(223 bp);大鼠C-myc sense:5'-CGAGCTGAAGCGTAGCTTTT-3'，C-myc antisense:5'-CTCGCCGTTTCCTCAGTAAG-3'(170 bp)。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃10 min，變性95 ℃15 s，退火56 ℃20 s，延伸72 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)。每組重復(fù)3 次。PCR 結(jié)果分析:以GAPDH 作為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。組間方差不齊時(shí)采用Satterthwaite 校正t 檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 醛固酮對(duì)大鼠系膜細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組系膜細(xì)胞形狀不規(guī)則，胞體可呈長梭形、星形、紡錘形或樹枝狀，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)多向外伸出樹枝狀突起，長短不一。細(xì)胞密度較大時(shí)，系膜細(xì)胞可疊加生長，形成相互交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)。醛固酮組系膜細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察系膜細(xì)胞形態(tài)(×100)Figure 1 Effects of aldosterone on mesangial cell morphology(×100)

2.2 醛固酮對(duì)大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示醛固酮組系膜細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高［(32.87±4.98)%vs(68.62±1.77)%，P ＜0.05］。見圖2。

2.3 醛固酮對(duì)凋亡相關(guān)基因P53、Bcl-2、C-myc mRNA 表達(dá)的影響 RT-PCR 結(jié)果顯示，醛固酮組P53 基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯上升(2.82±0.35 vs 1.00±0.09，P ＜0.05)、Bcl-2 基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降(0.11±0.01 vs 1.00±0.24，P ＜0.05)、C-myc 基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著上升(1.85±0.35 vs 1.00±0.12，P ＜0.05)。

圖2 醛固酮對(duì)大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effects of aldosterone on mesangial cell apoptosis

3 討 論

CKD 進(jìn)展惡化將導(dǎo)致慢性腎衰竭，是危害人類健康的主要疾病之一。作為腎疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，長久以來人們一直在探討影響CKD 進(jìn)展的因素并試圖尋找延緩或阻止其發(fā)生發(fā)展的新策略。已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究結(jié)果顯示，RAAS 激活是引起CKD 發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要的機(jī)制［6-7］，且越來越多的證據(jù)提示醛固酮可能作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素直接參與腎損害［8］，是CKD 進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵遞質(zhì)。但是人們對(duì)于醛固酮與腎損害關(guān)系的認(rèn)識(shí)只是初步的，其確切機(jī)制并未完全明了。

細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下、由一系列酶參與、基因調(diào)控的一個(gè)主動(dòng)死亡過程。細(xì)胞凋亡對(duì)于胚胎發(fā)育及維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。慢性腎疾病的發(fā)生發(fā)展的過程中，細(xì)胞凋亡扮演了非常重要的角色［9-11］?？杀憩F(xiàn)為系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞等的凋亡［12］，干預(yù)腎疾病細(xì)胞的凋亡及調(diào)控基因，可能會(huì)阻止腎疾病的進(jìn)展［13］。本研究結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，醛固酮組系膜細(xì)胞凋亡率明顯升高，且醛固酮組P53 基因、C-myc 基因表達(dá)明顯升高，Bcl-2基因表達(dá)明顯下降，提示醛固酮可能通過上調(diào)P53基因及C-myc 基因的表達(dá)，并下調(diào)Bcl-2 基因的表達(dá)引起系膜細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與凋亡基因的獨(dú)立作用及相互間的協(xié)同作用有關(guān)。環(huán)孢素作為治療腎疾病的常見藥物，其顯著的不良反應(yīng)也備受關(guān)注，引起系膜細(xì)胞的凋亡是否參與其中，仍不明確。Han等［14］報(bào)道環(huán)孢素也可通過上調(diào)P53 基因并下調(diào)Bcl-2 基因的表達(dá)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡。另有研究表明糖尿病腎病伴隨的系膜細(xì)胞凋亡可能是促進(jìn)腎衰竭的重要因素［15］，可見系膜細(xì)胞損傷在CKD 的疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。醛固酮除可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡外，Chen 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮也可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，多種損傷因素共同作用，共同促進(jìn)疾病的進(jìn)展及惡化。同時(shí)已有研究表明，醛固酮受體拮抗劑可對(duì)抗醛固酮引起的系膜細(xì)胞凋亡［3，16］，但是其對(duì)腎損傷的影響仍不清楚。本文結(jié)果提示，醛固酮可能通過上調(diào)P53 基因及C-myc 基因的表達(dá)，并下調(diào)Bcl-2 基因的表達(dá)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，推測(cè)系膜細(xì)胞凋亡增加可能是醛固酮引起的腎損傷的機(jī)制之一。因此本研究結(jié)果可以為醛固酮在腎損害的作用機(jī)制研究中提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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