王東麟，吳 龍，林 靜，趙 今

0 引 言

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是一種口腔常見病、多發(fā)病，也被認(rèn)為是骨疾病的一種，其表現(xiàn)形式為骨質(zhì)疏松。已有多項(xiàng)研究證實(shí)骨質(zhì)疏松癥是牙周病的一項(xiàng)危險(xiǎn)因素［1－2］。雌激素可調(diào)控骨代謝，具有影響骨生長與變異分化、維持正常的骨轉(zhuǎn)換等多功能作用。雌激素受體(estrogen receptor，ER)是其特異受體，具有組織細(xì)胞特異性的ER-α和ER-β 被認(rèn)為是影響骨量和骨質(zhì)疏松的潛在候選基因［3］。由于地域、環(huán)境、民族等不同，雌激素受體基因多態(tài)性與牙周疾病的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系尚未達(dá)成一致結(jié)論。有文獻(xiàn)顯示，新疆墨玉地區(qū)牙周病發(fā)病率高達(dá)65.2%［4］。本研究旨在了解新疆墨玉地區(qū)維吾爾族成人ERα 與ERβ 基因型的分布情況，探討ER 基因型與成人慢性牙周炎之間相關(guān)性，為該地區(qū)維吾爾族成人慢性牙周炎危險(xiǎn)性的預(yù)測和防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究設(shè)計(jì)在墨玉地區(qū)采用分層隨機(jī)抽樣的方法進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并收集口腔樣本。提取該地區(qū)中、重度慢性牙周炎和牙周健康者的全基因組DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法進(jìn)行基因分型及分析，實(shí)驗(yàn)群體選自前期流行病學(xué)調(diào)查采集樣本?？偣布{入199 例個(gè)體，實(shí)驗(yàn)分為牙周炎組和對照組，牙周炎組包括97 例中、重度牙周炎患者(男50 例、女47 例)，對照組包括102 例牙周健康者(男48 例、女54 例)。所有研究對象均為維吾爾族，年齡18 ～70歲。中、重度牙周炎的分型標(biāo)準(zhǔn):附著水平(attachment level，AL)≥3 mm。牙周炎組納入標(biāo)準(zhǔn)包括:口內(nèi)至少有10 顆牙可以進(jìn)行牙周檢查，其中包括4 顆磨牙(不含第三磨牙);③所有牙周炎組個(gè)體均無系統(tǒng)性疾病及已知可影響牙周狀況的疾病。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)包括:無系統(tǒng)性疾病，口腔衛(wèi)生情況良好，牙齦無異常，無附著喪失，牙齒無松動(dòng)，缺失牙不超過3 顆。2 組研究對象均排除懷孕女性并填寫知情同意書。本研究通過本院倫理委員會(huì)審查(20140529-01)。

1.2 研究方法 采集每位受試者的口腔頰黏膜拭子標(biāo)本，無菌棉拭子刮取雙側(cè)頰黏膜脫落細(xì)胞，室溫下自然干燥過夜，置于無菌試管中，－20 ℃保存。消毒剪刀將拭子棉絮剝?nèi)≈岭x心管，采用口腔拭子基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生物有限公司)提取DNA，－20℃保存。采用PCR-RFLP 方法檢測受試者ER-α、β 的基因型和等位基因。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，凝膠成像儀上確定基因分型。

1.3 PCR 質(zhì)量控制措施 為保證基因分型結(jié)果無偏移，所有標(biāo)本均在盲法下進(jìn)行測定。隨機(jī)抽取10%樣本在單盲情況下重復(fù)測定各位點(diǎn)基因型，以檢驗(yàn)所測基因型的重復(fù)性和可靠性。基因引物序列及PCR 反應(yīng)條件見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(百分率)形式表達(dá)。牙周炎組和對照組基因型分布和等位基因頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，單因素Logistic 回歸模型分析ER基因型的危險(xiǎn)因素。以P≤0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 ER 基因引物序列及PCR 反應(yīng)條件Table 1 ER genomic primer sequences and PCR reaction condition

2 結(jié) 果

2.1 ER-α XbaⅠ和PvuⅡ基因型分布 牙周炎組與對照組在XbaⅠ基因型表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.180 9)，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036 6)。牙周炎組與對照組在Pvu Ⅱ基因型表達(dá)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021 5)，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014 6)。見圖1、圖2，表2。

圖1 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后電泳圖Figure 1 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme XbaⅠdigestion

圖2 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切后電泳圖Figure 2 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme PvuⅡdigestion

表2 牙周炎組和對照組中的ER 基因型分布［n(%)］Table 2 Distribution of ER genotype in the patients and healthy controls n(%)

2.2 ER-β RsaⅠ和AluⅠ基因型分布 牙周炎組與對照組在RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.180 9、P=0.094 9)，牙周炎組與對照組在AluⅠ基因型表達(dá)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.059 4)，其等位基因頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048 3)。見圖3、圖4，表2、表3。

2.3 男性研究對象ER-α XbaⅠ與PvuⅡ以及ER-β RsaⅠ與AluⅠ基因型分布 牙周炎組男性與對照組男性在XbaⅠ基因型表達(dá)和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.174 6、P=0.065 5)，在PvuⅡ基因型表達(dá)和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.173 4、P=0.208 0)。牙周炎組與對照組在RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.409 5、P=0.444 3)，在AluⅠ基因型表達(dá)和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.112 9、P=0.065 2)。見表4、表5。

圖3 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切后電泳圖Figure 3 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme RsaⅠdigestion

圖4 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AluⅠ酶切后電泳圖Figure 4 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme AluⅠdigestion

表3 牙周炎組和對照組的等位基因分布［n(%)］Table 3 Distribution of ER allele in the patients and healthy controls n(%)

2.4 女性研究對象ER-α XbaⅠ與PvuⅡ以及ER-β RsaⅠ與AluⅠ基因型分布 牙周炎組女性與對照組在XbaⅠ基因型表達(dá)和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.178 2、P=0.213 5)，在PvuⅡ基因型表達(dá)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.074 7)，在其等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022 9)。2 組女性RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.121 5、P=0.154 4)，在AluⅠ基因型表達(dá)和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.453 2、P=0.337 8)。見表6、表7。

2.5 ER 基因型的單因素Logistic 分析 單因素Logistic 分析顯示，攜帶Aa 基因型的人群的患病的風(fēng)險(xiǎn)是AA 基因型人群的0.032 倍(95%CI:0.28 ～0.93，P=0.032)，說明Aa 基因型是患牙周炎的保護(hù)因素。見表8。

表4 男性研究對象的ER 基因型分布［n(%)］Table 4 Distribution of ER genotype in the male patients and healthy controls n(%)

表5 男性研究對象的等位基因分布［n(%)］Table 5 Distribution of ER allele in the male patients and healthy controls n(%)

表6 女性研究對象的ER 基因分布［n(%)］Table 6 Distribution of ER genotype in the female patients and healthy controls n(%)

表7 女性研究對象的等位基因分布［n(%)］Table 7 Distribution of ER allele in the female patients and healthy controls n(%)

表8 ER 基因型單因素Logistic 分析結(jié)果Table 8 One-way logistic analysis of ER genotype

3 討 論

ER 分為ER-α 和ER-β 2 個(gè)亞型。ER-α 主要表達(dá)于睪丸、子宮、骨等器官;ER-β 主要表達(dá)于前列腺、卵巢、骨等器官。近年來大量的研究證明ER 基因多態(tài)性與骨密度之間存在關(guān)聯(lián)，一些研究報(bào)道了ER-α 基因多態(tài)性與骨密度之間有一定的聯(lián)系［5－7］。有研究結(jié)果顯示，XX 和PP 基因型對于腰椎骨密度具有保護(hù)作用，尤其是對絕經(jīng)前女性及西方女性更為明顯;而對于股骨頸骨密度，XX 基因型具有保護(hù)作用，PP 基因型則可能引起負(fù)面作用［8］。研究人群之間種族、年齡和環(huán)境的差異或許可以解釋上述研究結(jié)果不一致的現(xiàn)象。但同時(shí)也有其他文獻(xiàn)未得出相同結(jié)果［9］。牙槽骨是全身骨骼的一部分，引起全身骨質(zhì)疏松的因素極大可能會(huì)引起牙槽骨的骨質(zhì)疏松。Yoshihara 等［1］對日本新瀉地區(qū)70 歲以上居民的研究結(jié)果顯示骨密度與牙周炎存在顯著關(guān)聯(lián)。Ozturk 等［2］對土耳其地區(qū)居民研究結(jié)果顯示下頜骨骨密度的參數(shù)和牙周破壞表現(xiàn)為明顯的負(fù)相關(guān)。

新疆墨玉地區(qū)維吾爾族占人口絕大多數(shù)，人口流動(dòng)少，具有穩(wěn)定的環(huán)境和其獨(dú)特的生活習(xí)慣，慢性牙周炎的發(fā)病也有其特點(diǎn)。本研究中發(fā)現(xiàn)在ER-α中，牙周炎組與對照組在XbaⅠ基因型表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ER-α基因XbaⅠ多態(tài)性可能與新疆墨玉地區(qū)維吾爾族人群牙周易感性無相關(guān)關(guān)系，而等位基因與人群慢性牙周炎發(fā)病存在相關(guān)性;牙周炎組與對照組在PvuⅡ基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ER-α基因PvuⅡ可能為導(dǎo)致新疆墨玉維吾爾族人群慢性牙周炎的易感因子，其等位基因與慢性牙周病的發(fā)病也存在相關(guān)性。這與馬敏等［10］研究結(jié)果相似。經(jīng)過單因素Logistic 分析后發(fā)現(xiàn)，擁有pp 基因型的人群的患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)是擁有PP 基因型的人群的2.25 倍。攜帶Aa 基因型的人群的患牙周炎風(fēng)險(xiǎn)是AA 基因型人群的0.032 倍，說明Aa 基因型是患牙周炎的保護(hù)因素。在ER-β 中，牙周炎組與對照組在RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2 組在AluⅠ基因型表達(dá)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示AluⅠ基因型的分布可能與新疆墨玉維吾爾族慢性牙周炎無相關(guān)性，但等位基因可能與新疆墨玉維吾爾族慢性牙周炎易感性相關(guān)。女性相比于男性更易出現(xiàn)激素失調(diào)。一些研究表明，ER-α 基因多態(tài)性與性別相關(guān)疾病有關(guān)，且是流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素［11－13］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，性別對牙周病的影響中，女性比男性更易發(fā)生［14］。據(jù)推測，ER-α 基因多態(tài)性對牙周炎的影響可能在不同性別間有不同表現(xiàn)，故本研究以性別對分組依據(jù)。值得注意的是女性慢性牙周炎患者和對照組表現(xiàn)出更明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而男性患者和對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Zhang等［15］在研究中發(fā)現(xiàn)ER-α 在女性慢性牙周炎組和對照組中的結(jié)果相似。但經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，性別并非ER-α 的干擾因素，說明該地區(qū)ER 基因多態(tài)性對牙周炎的影響與性別無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對ER-β RsaⅠ多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)，199 例受檢者結(jié)果未出現(xiàn)rr 基因型，尚未發(fā)現(xiàn)與此結(jié)果相似的研究，這可能與新疆墨玉地區(qū)維吾爾族人種有關(guān)，故還需擴(kuò)大樣本量及在新疆不同地區(qū)維吾爾族中進(jìn)一步研究以證實(shí)。

本研究探討了ER 基因與新疆墨玉地區(qū)維吾爾族成人中、重度牙周炎的關(guān)系，初步證實(shí)新疆墨玉地區(qū)維吾爾族成人中、重度慢性牙周炎易感性與ER-α、ER-β 基因型分布相關(guān)。由于本研究中，前期流行病學(xué)調(diào)查并未檢查人群的骨質(zhì)疏松指數(shù)，故在今后的研究中需不斷完善，加大樣本量，以進(jìn)一步證實(shí)ER基因多態(tài)性與維吾爾族慢性牙周炎的相關(guān)性，以及深入研究雌激素受體基因多態(tài)性與維吾爾族慢性牙周炎的發(fā)病機(jī)制。

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