王怡丹, 孫天瞳, 劉建國(guó),3, 柴巧學(xué), 曲云鵬, 于曉光, 白國(guó)輝,3, 田 源,3, 韓 琪

(貴州 遵義: 1. 遵義市第一人民醫(yī)院口腔科, 563002; 2. 遵義醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科學(xué)教研室, 563099;3. 貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 563099)

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嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG的構(gòu)建及表達(dá)研究

王怡丹1,3, 孫天瞳2, 劉建國(guó)2,3, 柴巧學(xué)2, 曲云鵬2, 于曉光2, 白國(guó)輝2,3, 田 源2,3, 韓 琪2

(貴州 遵義: 1. 遵義市第一人民醫(yī)院口腔科, 563002; 2. 遵義醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科學(xué)教研室, 563099;3. 貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 563099)

目的: 構(gòu)建含變異鏈球菌表面蛋白SpaP的P區(qū)編碼基因spap- P和葡聚糖結(jié)合蛋白GbpA的葡聚糖結(jié)合區(qū)編碼基因gbd的嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG，并觀察其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T中的表達(dá)。方法：通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中；然后分別采用免疫組化SABC法和Western- blot檢測(cè)嵌合蛋白SpaP/P- GBD在真核細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定證實(shí)，其所攜帶的外源基因片段為2.4 kb的目的基因片段，序列同源性為99%；免疫組化染色結(jié)果顯示，經(jīng)pVAX1- SPG轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色染色；Western- blot檢測(cè)結(jié)果顯示，分子量為72 kDa的嵌合蛋白SpaP/P- GBD能夠被正確表達(dá)。結(jié)論： 構(gòu)建成功的嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG能在真核細(xì)胞293T中正確表達(dá)目的蛋白。

變異鏈球菌; 表面蛋白抗原; 葡聚糖結(jié)合蛋白; 哺乳動(dòng)物細(xì)胞; 真核表達(dá)

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(11):645]

齲病是口腔的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其主要致病菌為變異鏈球菌。變異鏈球菌的主要致齲作用是其對(duì)牙面的粘附、聚集、產(chǎn)酸和耐酸。表面蛋白(surfaceprotein antigen，SpaP)又被不同學(xué)者命名為PAc、P1和AgI/Ⅱ 等，是變異鏈球菌的主要粘附素(adhesins)。有研究表明，SpaP在介導(dǎo)變異鏈球菌對(duì)牙面的蔗糖非依賴性粘附中起著關(guān)鍵作用，被視為變異鏈球菌族細(xì)菌的主要毒力因子之一[1]。葡聚糖結(jié)合蛋白(glucan bind protein，Gbp)是變異鏈球菌菌細(xì)胞表面的葡聚糖結(jié)合受體，其在變異鏈球菌參與的蔗糖依賴性粘附中起著關(guān)鍵的作用。目前已有4種不同的Gbp被相繼發(fā)現(xiàn)，分別為GbpA、GbpB、GbpC和GbpD。GbpA的葡聚糖結(jié)合區(qū)(glucan- binding domain，GBD)被認(rèn)為是介導(dǎo)變異鏈球菌粘附的重要功能區(qū)，與牙菌斑生物膜的形成關(guān)系密切[2]。本研究擬構(gòu)建含變異鏈球菌表面蛋白SpaP的功能區(qū)P區(qū)編碼基因spap- P和葡聚糖結(jié)合蛋白GbpA的功能區(qū)葡聚糖結(jié)合區(qū)編碼基因gbd的嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG，并觀察其在真核細(xì)胞293T中的表達(dá)，以期為下一步嵌合體基因防齲疫苗pVAX1- SPG的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

PrimeSTAR? HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶、In- Fusion Advantage PCR Cloning Kit連接試劑盒、DNA分子量Marker λ- Hind Ⅲdigest、DNA分子量Marker DL2000(大連寶生物公司)；質(zhì)粒pVAX1和lipofectamine 2000(Invitrogen, 美國(guó))；GoldViewTM核酸染料(北京賽百盛)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma, 美國(guó))；胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；SABC試劑盒(武漢博士德)；質(zhì)粒提取試劑盒(北京TIANGEN)；抗SpaP的IgG抗體和抗GBD的 IgG抗體(本課題組前期制備)；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(Amresco，美國(guó))。

1.1.2 質(zhì)粒及細(xì)胞株

含基因spap- P和gbd的重組質(zhì)粒pVAX1-SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD(本課題組前期構(gòu)建)[3-4];大腸桿菌JM109(中科院成都生物所馬欣榮博士惠贈(zèng));293T細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所)。

1.2 方法

1.2.1 目的質(zhì)?？寺?/p>

分別取重組質(zhì)粒pVAX1- SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD，經(jīng)高頻轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的JM109細(xì)胞后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中報(bào)道的spap- P和gbd序列設(shè)計(jì)引物，并交大連寶生物公司進(jìn)行引物合成(表1)。

表1 PCR引物序列

在spap-P上游引物中引入Kpn I酶切位點(diǎn)GGTACC和Kosak序列ACCACCACCATG，在spap-P下游引物的互補(bǔ)序列和gbd上游引物上設(shè)計(jì)相同的15個(gè)堿基序列GATAATCCAAGAGAA，在gbd下游引物增加EcoR I的酶切位點(diǎn)GAATTC和終止密碼子TAG。

1.2.2.2 PCR 擴(kuò)增目的片段

PCR 反應(yīng)體系共50 mL，分別為：質(zhì)粒pVAX1-SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD各0.5 μL，spap- P或gbd上游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，spap- P或gbd下游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，5×PrimeSTAR Buffer(Mg2-plus)10 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 33.5 μL。反應(yīng)條件為(98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min)×30循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 重組質(zhì)粒pVAX1- SPG的構(gòu)建及鑒定

嚴(yán)格按相關(guān)試劑盒操作說(shuō)明純化回收PCR產(chǎn)物，并用內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I 對(duì)載體pVAX1進(jìn)行酶切和回收。然后用In- Fusion Advantage PCR Cloning連接試劑盒對(duì)上述酶切回收的產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系共10 μL, 分別為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物spap- P 1μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物gbd 1μL，載體質(zhì)粒pVAX1 1μL，5×In- Fusion Reaction Buffer 2μL，In- Fusion Enzyme 1μL，ddH2O 4 μL。連接條件為37 ℃ 15 min，50 ℃ 15 min。上述連接完成后，取1 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。并將轉(zhuǎn)化后的JM109 涂布于含20 μg/mL 卡那霉素的LB抗性篩選平板上，置于37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)16 h后挑取單個(gè)菌落，再置于37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，并進(jìn)行質(zhì)粒提取。所提取的質(zhì)粒通過(guò)Kpn I 和EcoR I 雙酶切進(jìn)行鑒定后，即得到與目的基因大小相符的條帶，然后將其送寶生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒pVAX1- SPG的表達(dá)鑒定

1.2.4.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)pVAX1- SPG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

取293T細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)后，用DMEM制成密度1.0×105/mL的細(xì)胞懸液，并將其接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)預(yù)先放置的載玻片上(每孔2 mL)；常規(guī)條件下培養(yǎng)至24 h細(xì)胞匯合達(dá)80%進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，利用 lipofectamine 2000 分別將8 μg重組質(zhì)粒pVAX1- SPG和8 μg pVAX1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組293T細(xì)胞中。所有操作均嚴(yán)格按SABC試劑盒說(shuō)明。

1.2.4.2 免疫組化染色觀察重組質(zhì)粒pVAX1-SPG在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用免疫組化SABC法檢測(cè)重組質(zhì)粒pVAX1- SPG在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。具體方法如下：分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞爬片，用40 g/L多聚甲醛固定后，PBS漂洗5 min×3次；滴加30 mL/L過(guò)氧化氫液室溫孵育10 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加50 g/L BSA封閉液37 ℃ 封閉30 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加抗SpaP或抗GBD的 IgG抗體(1 ∶150)4 ℃孵育過(guò)夜；37 ℃復(fù)溫30 min后PBS漂洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加SABC復(fù)合物37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色、蘇木素復(fù)染；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.4.3 Western- blot檢測(cè)嵌合蛋白SpaP/P-GBD在細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，分別離心收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的293T細(xì)胞，并經(jīng)蛋白裂解液裂解后提取其總蛋白。所提取的蛋白樣品經(jīng)120 g/L的SDS- PAGE 膠進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)移至NC 膜上，并用含100 g/L BSA 的PBS進(jìn)行封閉；然后再分別用稀釋的一抗和酶標(biāo)記的IgG二抗進(jìn)行免疫標(biāo)記。標(biāo)記結(jié)束后，滴加ECL發(fā)光試劑進(jìn)行激發(fā)，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白的SDS- PAGE 膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pVAX1- SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD的酶切鑒定

本課題組前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAX1- SpaP/P經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后，可得到大小約3.0 kb 和1.2 kb的片段(圖1)；pVAX1- GbpA/GBD經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切后，亦可得到大小約3.0 kb和1.2 kb的片段(圖2)，均與目的片段大小相符。

圖1 pVAX1-SpaP/P酶切產(chǎn)物 圖2 pVAX1-GbpA/GBD酶切產(chǎn)物

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收電泳結(jié)果

以重組質(zhì)粒pVAX1- SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，分別擴(kuò)增出了1.2 kb的spap- P片段和1.2 kb的gbd片段，其分子量均與預(yù)計(jì)的大小相同(圖3)。

2.3 重組質(zhì)粒pVAX1- SPG的酶切鑒定和測(cè)序分析

重組質(zhì)粒pVAX1- SPG經(jīng)Kpn I和EcoR I雙酶切后，可得到大小約3.0 kb和2.4 kb大小的片段(圖4)；委托寶生物工程公司使用T7、BGHrev進(jìn)行測(cè)序分析，該序列核苷酸同源性與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性達(dá)到99%，表明目的基因順利嵌合到載體pVAX1中，成功構(gòu)建出重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG。

圖3 目的基因spap-P,gbd PCR結(jié)果 圖4 pVAX1-SPG酶切產(chǎn)物

2.4 重組質(zhì)粒pVAX1- SPG在真核細(xì)胞中的表達(dá)鑒定

2.4.1 免疫染色結(jié)果

SABC法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h免疫組化染色結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX1- SPG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕褐色染色； pVAX1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞質(zhì)無(wú)著色(圖5～6)。提示，將pVAX1- SPG轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白能夠與抗體特異性結(jié)合，具有抗原性。

圖5 空載體質(zhì)粒pVAX1轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞免疫組化結(jié)果(×400) 圖6 重組質(zhì)粒pVAX1-SPG轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞免疫組化結(jié)果(×400)

2.4.2 Western- blot檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染48 h后，分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western- blotting分析顯示，轉(zhuǎn)染pVAX1- SPG的實(shí)驗(yàn)組中，其表達(dá)產(chǎn)物嵌合蛋白SpaP/P- GBD能與SpaP和GBD發(fā)生對(duì)應(yīng)的抗體反應(yīng)，在72 kDa處可見(jiàn)陽(yáng)性條帶；而轉(zhuǎn)染空載體pVAX1的對(duì)照組中未出現(xiàn)特異性條帶(圖7)。以上結(jié)果說(shuō)明，表達(dá)的外源蛋白具有免疫活性結(jié)構(gòu)，構(gòu)建的質(zhì)粒pVAX1- SPG可以在293T細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖7 細(xì)胞總蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色和表達(dá)產(chǎn)物的Western- blot分析

3 討論

變異鏈球菌是目前公認(rèn)的重要致齲菌之一，其表面抗原SpaP可介導(dǎo)其對(duì)牙面的非蔗糖依賴性粘附，是目前研究較多的毒力因子。變異鏈球菌表面蛋白SpaP蛋白分子中間存在2～3個(gè)由39個(gè)氨基酸殘基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，該序列富含脯氨酸，呈伸展?fàn)顟B(tài)的β片層結(jié)構(gòu)，同時(shí)還富含T、B細(xì)胞表位，稱之為P區(qū)。P區(qū)能夠誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，是理想的防齲疫苗基因選擇區(qū)。

變異鏈球菌能合成多種胞外多糖，其中Gbp在變異鏈球菌參與的蔗糖依賴性口腔菌斑生物膜形成中起著關(guān)鍵的作用。多數(shù)研究表明，GbpA的GBD是介導(dǎo)變異鏈球菌粘附的重要功能區(qū)，有較好的免疫原性。吳補(bǔ)領(lǐng)等[5]報(bào)道，將GbpA的GBD蛋白經(jīng)皮下注射免疫SD大鼠后，能夠誘導(dǎo)抗GBD抗體的產(chǎn)生。蘇凌云等報(bào)道[6]，將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1- GBD經(jīng)頜下腺區(qū)注射免疫SD大鼠后，可使 SD大鼠的齲病發(fā)生率和患齲程度明顯降低。

嵌合體防齲疫苗是利用基因工程技術(shù)將兩種或兩種以上的基因或其功能片斷連接起來(lái)，并通過(guò)直接免疫機(jī)體或通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、植物等宿主后，再經(jīng)誘導(dǎo)使其表達(dá)，以獲取具有抗原成分的融合蛋白；然后再用該蛋白免疫機(jī)體，即可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)抗原的保護(hù)性免疫。這兩個(gè)或多個(gè)基因可以是具有協(xié)同效用的抗原基因或片斷，也可以是抗原基因和免疫佐劑的編碼基因，均可通過(guò)連接而增強(qiáng)疫苗的效能[7-8]。目前嵌合體防齲疫苗常用的候選基因主要有：①變異鏈球菌族細(xì)菌表面蛋白及其功能區(qū)編碼基因，雖然表面蛋白的命名有所不同，但其核苷酸序列和蛋白序列具有高度的同源性，且具有較好的免疫原性[7]；有學(xué)者通過(guò)將變異鏈球菌表面蛋白PAc的A區(qū)、P區(qū)及葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF- I的編碼葡聚糖結(jié)合區(qū)GLU的基因序列克隆到真核載體pCI后，構(gòu)建了嵌合表達(dá)載體pGLUA- P，并證實(shí)該重組質(zhì)粒能夠在原核、真核細(xì)胞中表達(dá)正確的GLU- A- P融合蛋白[9-10]; ②葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其功能區(qū)編碼基因，有研究表明，葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF- I的催化活性區(qū)CAT的抗體能抑制變異鏈球菌合成水溶性和水不溶性葡聚糖；葡聚糖結(jié)合區(qū)GLu含有重要的抗原決定簇，能抑制GTF- I的作用[3,11]。孫靜華[12-13]和Niu[14]等研制了包含表兄鏈球菌OMZl76GTF—I的CAT區(qū)和變異鏈球菌PAc、GLU基因序列的復(fù)合防齲DNA疫苗，將重組質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒分別經(jīng)股四頭肌注射和鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清和唾液中的抗PAc、抗GLU、抗CAT抗體水平均顯著高于空載體對(duì)照組。

嵌合體防齲疫苗常用的免疫佐劑主要有：霍亂毒素(cholera toxin，CT)及其亞單位CTB、不耐熱腸毒素(heat- labile enterotoxin, LT) 及其B亞單位 (LTB)和CpG免疫刺激序列、一些細(xì)胞因子和沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白等；這些佐劑均能有效提高抗原的免疫原性，且可降低免疫耐受的發(fā)生[15-16]，其編碼基因不僅能通過(guò)與抗原基因連接而表達(dá)融合蛋白，同時(shí)還能表達(dá)兼具兩者活性的產(chǎn)物。楊小青等[17]對(duì)編碼PAcA的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增后，通過(guò)T- A克隆技術(shù)將目的DNA 片段克隆于載體pMD18- T，并進(jìn)一步亞克隆于含有CpG免疫刺激序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，從而成功構(gòu)建了含有免疫刺激序列且可防止變異鏈球菌在牙面粘附的DNA疫苗pcDNA3.1- PAcA。Shi等[18]將鞭毛素蛋白佐劑和抗原PAc融合成功構(gòu)建了一個(gè)既包含黏膜佐劑又包含疫苗目標(biāo)抗原的重組蛋白，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用該蛋白經(jīng)鼻腔黏膜免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效的特異抗體應(yīng)答，尤其是口腔特異IgA抗體應(yīng)答。

防齲疫苗的研究已有70余年的歷史。我國(guó)在防齲基因疫苗領(lǐng)域的研究已處于國(guó)際先進(jìn)水平，且已研制出了針對(duì)變異鏈球菌單個(gè)或多個(gè)毒力因子的基因疫苗，并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)均有較好的防齲效果，其中以針對(duì)兩種毒力因子的嵌合體基因疫苗的保護(hù)作用更好[19-20]。盡管如此，嵌合體防齲基因疫苗的研究仍存在以下一些問(wèn)題[7-8]：①不同的變異鏈球菌粘附素有所不同，與之反應(yīng)的配體也不同(不同的配體在蛋白分子中會(huì)有相應(yīng)的粘結(jié)位點(diǎn))，當(dāng)粘附素與不同狀態(tài)的配體結(jié)合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的生物學(xué)意義(與附著在固相表面的配體結(jié)合會(huì)促進(jìn)變異鏈球菌在牙齒表面的粘附，而與液相配體結(jié)合則會(huì)促進(jìn)變異鏈球菌凝集，有利于對(duì)致齲菌的非免疫性清除)；②基因重組多肽的表達(dá)宿主、純化方式不同，會(huì)導(dǎo)致其生物學(xué)性能的改變。③以融合蛋白形式制備的多肽在空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性上可能會(huì)受到相互之間不同程度的影響，這也是不同研究者用同一抗原的相同免疫活性區(qū)段進(jìn)行多肽研究時(shí)，所得到的結(jié)論不同甚至完全相反的原因之一；④多肽粘附能力可能與其鏈的長(zhǎng)度有關(guān)，過(guò)短的肽鏈因不能提供充足的結(jié)合位點(diǎn)，往往觀察不到粘附作用；⑤蛋白、酶等抗原分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)仍不確定，通過(guò)基因工程技術(shù)制備的用于粘附相關(guān)研究的基因工程多肽的空間結(jié)構(gòu)與其蛋白的天然分子立體結(jié)構(gòu)存在一定差異，而且這些多肽的結(jié)構(gòu)也不甚清楚。

本研究通過(guò)將變異鏈球菌的兩個(gè)重要毒力因子SpaP的P區(qū)編碼基因spap- P和GbpA的GBD編碼基因gbd進(jìn)行嵌合，構(gòu)建了嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1- SPG；經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)并證實(shí)，該重組質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中正確表達(dá)。從而為其后續(xù)的免疫原性研究，以及單個(gè)基因與嵌合基因免疫效果的對(duì)比研究奠定了基礎(chǔ)。

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《牙體牙髓牙周病學(xué)雜志》征訂

《牙體牙髓牙周病學(xué)雜志》(月刊)是國(guó)內(nèi)唯一的口腔內(nèi)科學(xué)專業(yè)雜志，由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院主辦，為中國(guó)科技核心期刊，入選北京大學(xué)《中文核心期刊要目總攬》。被美國(guó)化學(xué)文摘(CA)、美國(guó)《劍橋科學(xué)文摘(自然科學(xué)版)》(CSA)和波蘭《哥白尼索引》(IC)、英國(guó)《國(guó)際農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)研究中心》(CABI)、烏利希國(guó)際期刊指南(Ulrich's)等國(guó)際檢索系統(tǒng)收錄。

本刊設(shè)有基礎(chǔ)研究、臨床研究、流行病學(xué)、治療與應(yīng)用、短篇報(bào)道、病案報(bào)道、綜述、講座、技術(shù)革新等欄目，內(nèi)容包括齲病學(xué)、牙體修復(fù)學(xué)、牙髓病學(xué)、牙周病學(xué)以及兒童牙醫(yī)學(xué)、老年牙醫(yī)學(xué)、牙病預(yù)防學(xué)等許多領(lǐng)域。

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Construction and expression of recombinant eukaryotic plasmid pVAX1- SPG

WANG Yi- dan*, SUN Tian- tong, LIU Jian- guo, CHAI Qiao- xue,QU Yun- peng, YU Xiao- guang, BAI Guo- hui, Tian Yuan, Han Qi

(*TheFirstPeople′sHospitalofZunyiGuizhou,Zunyi563002,China)

AIM: : To construct the eukaryotic plasmid including surface protein antigen (SpaP) P domain (SpaP- P) and glucan binding domain (GBD) of glucan binding protein A (GbpA) ofStreptococcusmutans, and to observe the expression of recombinant plasmid pVAX1- SPG in mammalian cells 293T. METHODS: The eukaryotic plasmid pVAX1-SPG carrying encoding gene of GBD of GbpA and SpaP- P of SpaP ofStreptococcusmutanswas constructed by recombinant DNA technology. The eukaryotic plasmid was transfected into 293T cells by lipofectamine reagent. The transient expression of the protein in 293T cells was detected by immunochemistry technique and Western-blot. RESULTS: The recombinant plasmidp VAX1- SPG was obtained and identified by restriction endonuclease analysis. Immunohistological staining showed that positive expression of SpaP/P-GBD was detected in the plasma of 293T cells transfected with recombinant plasmid pVAX1-SPG. Western-blot confirmed the expression of the fusion protein SpaP/P- GBD in 293T cells. CONCLUSION: The eukaryotic plasmid pVAX1-SPG can be constructed. The target protein SpaP/P-GBD can be expressed correctively in 293T cells.

streptococcus mutans; surfaceprotein antigen; glucan- binding protein; mammalian cells; eukaryoticexpression

2014-10-11;

2015-03-20

貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目[黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2013)4026] 貴州省高等學(xué)校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(SZXK-201207-04) 省市科技合作專項(xiàng)資金項(xiàng)目[省市科合(2014)41號(hào)] 貴州省高等學(xué)校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目[黔教合KY字(2013)109]

王怡丹(1971-)，女，漢族，貴州遵義人。碩士，副主任醫(yī)師

劉建國(guó), E-mail：13087891001@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)11-0645-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.11.002