劉學(xué)杰，陳曉健

(1.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 煙臺(tái) 264000;2.煙臺(tái)海港醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264000)

小薊為多年生草本植物，俗稱青刺薊、刺兒菜，為菊科植物 Cirsium setosum(Willd)MB.的干燥地上部分，具有涼血、祛瘀、止血之功效，主要用于治療吐血，衄血，尿血，血淋，便血，血崩等［1～3］。咖啡酸是小薊具有止血療效的有效成分之一，屬有機(jī)酸，具有縮短血凝及出血時(shí)間的作用，并可代替凝血酶作血漿纖維蛋白質(zhì)平板法纖溶實(shí)驗(yàn)［4～7］，它的含量將直接影響小薊的止血功效。本文采用目前發(fā)展較快的高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)測(cè)定小薊中咖啡酸的含量，為控制小薊質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Beckman coulter高效毛細(xì)管電泳儀(PDA檢測(cè)器);AB265－S分析天平(梅特勒－托利多公司);JAC－500型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(山東省濟(jì)寧市奧波超聲電氣有限公司);Seven Multi pH計(jì)(梅特勒－托利多公司);咖啡酸對(duì)照品(批號(hào):110885－200102，含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純;試驗(yàn)用小薊采自山東省萊陽市，經(jīng)煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心姜慧禎主任中藥師鑒定為菊科植物Cirsium setosum(Willd)MB.。

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件 未涂層石英毛細(xì)管柱(75μm×50 cm，河北永年光導(dǎo)纖維廠);緩沖溶液為25mmol·L－1硼砂溶液;分離電壓20 kV;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm［8］。條件:0.1 mol·L－1NaOH 溶液，重蒸餾水。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 精密稱取咖啡酸12.10mg，置100mL具塞量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粗粉0.2g(干燥品)，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入5%甲酸的甲醇溶液25mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30min，取出，放冷，再稱定重量，用5%甲酸的甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液1mL置10mL量瓶中加5%甲酸的甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，即得［9，10］。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取咖啡酸對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.121mg·mL－1)1、2、4、6、8mL 至 10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得每1mL含咖啡酸12.1、24.2、48.4、72.6、96.8 μg，分別進(jìn)樣10μL，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=246446X－174807，r=0.9990。結(jié)果表明，在此色譜條件下，咖啡酸在進(jìn)樣量為0.121～0.968 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取咖啡酸對(duì)照品溶液(24.2 μg·mL－1)，重復(fù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算 RSD為1.12%，說明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取小薊藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、6、8 h 測(cè)定咖啡酸峰面積，計(jì)算 RSD 值為0.9%，表明供試品液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批小薊藥材5份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述相同色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算5份樣品中咖啡酸含量，結(jié)果RSD值為1.38%，表明試驗(yàn)的重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取已知咖啡酸含量的小薊藥材9份，每份約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入1.6628mg·mL－1咖啡酸溶液1.6、2.0、2.4mL，加入咖啡酸的量分別是2.6602、3.3252、3.9903mg，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述相同色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

本測(cè)定方法測(cè)得的咖啡酸的平均回收率為96.33%，符合含量測(cè)定的要求。

2.4.6 樣品的含量測(cè)定 分別取3批小薊藥材各0.2g，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定咖啡酸含量，結(jié)果見圖1、表2。

圖1 HPCE色譜圖

表2 含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 不同提取方法及溶劑的影響 咖啡酸的提取方法很多有冷浸法、加熱回流法、超聲法等，冷浸法不能將咖啡酸提取完全，加熱回流法會(huì)在提取咖啡酸的同時(shí)結(jié)晶出大量黃酮類化合物［11］，故本文選擇超聲法提取。提取咖啡酸的溶劑也很多，如水、甲醇、乙醇等，考慮到溶液的導(dǎo)電性對(duì)試驗(yàn)的影響故選擇5%甲酸的甲醇溶液。

3.2 不同緩沖液的影響 本文曾選擇不同濃度的磷酸鹽、硼砂緩沖溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25mmol·L－1的硼砂緩沖溶液分離效果最好，隨著緩沖液濃度的增加，遷移時(shí)間變長(zhǎng)，分離度變好，但緩沖液濃度過大時(shí)會(huì)由于產(chǎn)生熱效應(yīng)而影響分離，所以選擇最佳緩沖溶液濃度為 25mmol·L－1。

3.3 電壓的影響 本文考察了在 12、15、18、20、25、35 kV下在25mmol·L－1的硼砂緩沖溶液中運(yùn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，電壓對(duì)咖啡酸的分離非起決定作用，但是電壓能影響咖啡酸的分離速度，電壓的升高會(huì)增加離子的遷移速度，從而縮短分析時(shí)間，考慮到樣品的分離度，試驗(yàn)中所采用的20 kV電壓能使咖啡酸得到較好的分離效果。

HPCE相對(duì)于傳統(tǒng)的高效液相色譜法(HPLC)靈敏度更高、分離效果更快，本試驗(yàn)中利用HPCE法檢測(cè)小薊中咖啡酸的含量，取得了較好的分離效果，且操作簡(jiǎn)單、精度高，可發(fā)展為檢測(cè)咖啡酸的一種常用方法。

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