鄧陽陽，魏 偉，陳 彤， 薛偕華

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003)

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澤瀉湯對Ox-LDL介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞SM22a表達(dá)的影響

鄧陽陽1，魏 偉2，陳 彤1， 薛偕華2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003)

目的：觀察澤瀉湯對VSMCs標(biāo)志性蛋白SM22a表達(dá)的影響，研究其在抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化方面的作用。方法：用Ox- LDL(0.05mg/mL)處理大鼠VSMCs 24h，經(jīng)澤瀉湯醇提取物低中高濃度(0.075mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL)干預(yù)24h，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志性蛋白SM22a的表達(dá)情況。結(jié)果：與空白組比較，模型組(Ox-LDL誘導(dǎo))SM22a表達(dá)明顯降低(P<0.05)；經(jīng)澤瀉湯干預(yù)后，SM22a蛋白表達(dá)水平較模型組顯著增加(P<0.05)，且隨濃度增高呈遞增趨勢(P<0.05)。結(jié)論：澤瀉湯能明顯上調(diào)表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白SM22a的表達(dá)，表明澤瀉湯有一定的抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用。

澤瀉湯；動(dòng)脈粥樣硬化；血管平滑肌細(xì)胞；表型轉(zhuǎn)化

動(dòng)脈粥樣硬化(Athmsclerosis，AS)的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一，且近年來有年輕化的趨勢。血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs)的活化、遷移與增殖是AS病變發(fā)展的必要條件[1]。而眾多研究表明，VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型是VSMCs獲得病理性遷移和增殖的先決條件[2]，同時(shí)合成型VSMCs合成與分泌各種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)，在AS斑塊形成和發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此對VSMCs表型轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，對AS的防治具有重要意義。 澤瀉湯由澤瀉、白術(shù)配伍組成，為歷代醫(yī)家治療痰飲眩暈的效方?，F(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，本方具有利水、改善循環(huán)、降脂、抗AS等藥理作用，應(yīng)用范圍較為廣泛，但對其抗AS發(fā)病機(jī)理中VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)采用Ox-LDL誘導(dǎo)體外培養(yǎng)VSMCs，經(jīng)不同濃度澤瀉湯干預(yù)后，觀察其對VSMCs表型轉(zhuǎn)化能力的影響，研究其對抑制VSMCs 表型轉(zhuǎn)化的作用，為澤瀉湯的抗AS作用提供實(shí)驗(yàn)和臨床研究依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物及藥物

清潔級SD雄性大鼠40只，購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號:SCXK(閩)2012-0001]。澤瀉湯方：澤瀉60g,白術(shù)30g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院藥劑科。澤瀉、白術(shù)劑量嚴(yán)格按《金匱要略》 原方劑量比例制劑并提供，以上藥物均經(jīng)鑒定，符合《中華人民共和國藥典》(一部)2005年版有關(guān)規(guī)定。

1.2 儀器與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone有限公司；胎牛血清購自FAA有限公司；氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL,1.67mg/L)購自北京協(xié)生生物科技公司；SM22a抗體購自Abcam公司；DAB免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Therom公司，美國)；Leica DM IL LED倒置顯微鏡。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 大鼠VSMC分離培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠，無菌條件下，取頸總動(dòng)脈，放于含1%雙抗的20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剝離外層成纖維細(xì)胞、內(nèi)層內(nèi)皮細(xì)胞，剪碎VSMCs后，將其置于1.5mLEP管中，加入500μL II性膠原酶，放入37℃培養(yǎng)箱中過夜后，將EP管中組織液轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，加入3mL 1%雙抗的20%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 待細(xì)胞融合至80%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代， 取6～8代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2 澤瀉湯制備 按照中藥醇提法提取澤瀉湯，澤瀉湯復(fù)方90g(澤瀉60g，白術(shù)30g)，按上述組方稱取藥材，加8倍量75%乙醇浸泡0.5h，加熱回流2次，每次1.5h，過濾，濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，真空干燥成浸膏約15g，-20℃凍存?zhèn)溆谩＞芊Q取澤瀉湯醇提取浸膏20.6mg，加2.06mL超純水溶解，超聲30min，0.22μm濾膜過濾，配制成10mg/mL母夜。以無雙抗20%胎牛血清的培養(yǎng)基分別稀釋成0.075mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL作為干預(yù)培養(yǎng)基。

2.1.3 細(xì)胞干預(yù)分組 實(shí)驗(yàn)分為三組：空白組：大鼠VSMCs+無雙抗20%培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。模型組：大鼠VSMCs +含Ox-LDL (0.05mg/mL)的無雙抗20%培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。澤瀉湯干預(yù)組(低、中、高劑量組)：大鼠VSMCs +含Ox-LDL (0.05mg/mL)和澤瀉湯低中高濃度(0.075mg/m、0.3mg/mL、0.6mg/mL)無雙抗20%培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。

2.1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測SM22a表達(dá) 分組和處理方法同“2.1.3”項(xiàng)， 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作方法進(jìn)行。采用SM22a陽性染色以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為準(zhǔn)。選染色均勻的區(qū)域，在100倍視野下,取陽性平均灰度值做統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 結(jié)果

與空白組比較，模型組SM22a表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，澤瀉湯組SM22a表達(dá)顯著增加，且隨澤瀉湯濃度增高呈升高趨勢(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測SM22a表達(dá) (×200)

組別SM22a陽性平均灰度值空白組98.180±1.734*模型組(Ox-LDL0.05mg/mL)58.276±0.824澤瀉湯低劑量組(0.075mg/mL)69.199±0.351*澤瀉湯中劑量組(0.3mg/mL)74.260±1.083*△澤瀉湯高劑量組(0.6mg/mL)83.846±1.310*△◇

注：與模型組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，◇P<0.05。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosls，AS)是西方發(fā)達(dá)國家的主要死亡原因[3]，隨著我國人民生活水平提高和飲食習(xí)慣的改變，該病也逐漸成為主要死因。AS的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為多種細(xì)胞參與AS病變的形成，包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs[4]。VSMCs是一種高度特化的細(xì)胞，具有收縮型和合成型2種表型[5]，細(xì)胞表型決定了細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能。正常VSMCs為收縮型，細(xì)胞呈紡錘形，含有豐富的肌絲和結(jié)構(gòu)蛋白，主要維持動(dòng)脈管壁的正常功能，無增殖以及遷移能力；合成型VSMCs分化程度低或未分化，呈扁平形，肌絲和結(jié)構(gòu)蛋白含量少，與合成有關(guān)的細(xì)胞器豐富，分化、增殖以及合成和分泌基質(zhì)蛋白能力強(qiáng)，并可遷移入內(nèi)膜，形成相關(guān)病理改變。在多種病理因素的作用下，VSMCs的表型可由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型[6]，此過程稱為表型轉(zhuǎn)化。SM22a是近年發(fā)現(xiàn)的一種VSMCs表型標(biāo)志基因，僅在收縮型VSMCs中高表達(dá)，具有高度特異性[7-8]。焦磊等[9]以氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)作用于VSMCs，結(jié)果顯示SM22a表達(dá)下調(diào)，表明Ox-LDL促進(jìn)了VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)以O(shè)x-LDL(0.05mg/mL)體外誘導(dǎo)VSMCs，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測SM22a的表達(dá)，結(jié)果亦顯示，與空白組相比，模型組SM22a表達(dá)明顯降低。

近年來中藥在抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化方面研究越來越受到關(guān)注，李琦等[10]研究發(fā)現(xiàn)黃芪和當(dāng)歸不僅能抑制bFGF誘導(dǎo)的VSMCs增殖， 而且還可有效逆轉(zhuǎn)bFGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化。車賢達(dá)等[11]研究發(fā)現(xiàn)麝香保心丸能促使血管平滑肌細(xì)胞的表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)化。 澤瀉湯出自東漢張仲景《金匱要略》，現(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明,澤瀉湯具有利水、改善循環(huán)、降脂、抗AS等藥理作用，應(yīng)用范圍較為廣泛。王玉仙等[12]應(yīng)用澤瀉湯加味治療高脂血癥，發(fā)現(xiàn)該方可改善臨床癥狀，而且能調(diào)節(jié)患者血脂水平。但是澤瀉湯對VSMCs表型轉(zhuǎn)化影響方面還未見研究，本實(shí)驗(yàn)在Ox-LDL處理VSMCs的基礎(chǔ)上予以澤瀉湯干預(yù)后，結(jié)果顯示，與較模型組對比，其SM22a表達(dá)顯著上調(diào)，并且呈一定的濃度依賴性。

綜上所述，本研究表明，Ox-LDL促進(jìn)了VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，而澤瀉湯具有抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用，從而發(fā)揮其抗AS作用。對于澤瀉湯通過何種途徑來抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化，還需要進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-12-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473744);福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(WZSY201304);福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目 (2013-ZQN-20-28)

鄧陽陽(1986-)，女 ,福建中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)槟X血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

薛偕華(1978-)，男，福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院主任醫(yī)師，副教授，研究方向?yàn)槟X血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

R285.5;R972+.6

A

1673-2197(2015)05-0008-02

10.11954/ytctyy.201505004