丘 芬，張興燊,江海燕，梁欣娜，金 釗，閆守霞

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200)

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救必應(yīng)水提液對小鼠肝臟病理損害的治療作用研究

丘 芬，張興燊,江海燕，梁欣娜，金 釗，閆守霞

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200)

目的：研究救必應(yīng)水提液對小鼠肝臟病理損害的治療作用。方法：采用腹腔注射D-氨基半乳糖構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型，研究救必應(yīng)水提液的保肝作用。結(jié)果：救必應(yīng)水提液能降低D-氨基半乳糖實(shí)驗(yàn)性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性，降低小鼠肝臟中丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，改善小鼠肝組織病理改變。結(jié)論：救必應(yīng)水提液能抑制D-氨基半乳糖產(chǎn)生自由基造成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而起到保護(hù)肝臟的作用。

肝損傷；救必應(yīng);小鼠；病理機(jī)制

救必應(yīng)為冬青科常綠喬木植物鐵冬青(IlexrotundaThund.)的干燥樹皮，是南方常用的中草藥,長江流域以南和中國臺灣有著豐富的天然資源。其味苦、性寒,歸脾、腎經(jīng),有清熱解毒、涼血止血、行氣止痛等功效,常用于癍痧發(fā)熱、感冒發(fā)熱、乳娥、脘腹脹痛、腹瀉、痢疾的治療,外用治燒燙傷[ 1-2 ]。民間瑤醫(yī)用于治療急、慢性肝炎有效[3-4 ]?，F(xiàn)代藥理研究多集中于其在心血管[5-6 ]、胃腸道及抗菌作用機(jī)制方面[7]，對救必應(yīng)治療肝炎的藥理作用研究較少，本研究通過構(gòu)建肝炎動物模型,觀察救必應(yīng)水提液對血清轉(zhuǎn)氨酶及肝臟過氧化系統(tǒng)的影響,為進(jìn)一步開發(fā)救必應(yīng)治療肝炎的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

救必應(yīng)水提液由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院炮制教研室提供，濃度為2g原生藥/mL，根據(jù)需要配成適當(dāng)濃度；D-氨基半乳糖(批號20090921，供應(yīng)商MBCHEM)； ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒(批號20120327)；AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒(批號20120326)；MDA(丙二醛)試劑盒(批號20120320)； SOD(超氧化物歧化酶)試劑盒(批號20120326)；考馬斯亮蘭試劑盒(批號20120323)，均購于南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙脂滴丸(批號110602，浙江萬邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明種小白鼠，18～22g，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：0006915。

1.3 儀器

臺式離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號：TGL-16k)、全波長酶標(biāo)儀(EPOCH- BIOTEK)，雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號：TV-1901)，電子天平(METTLER TOLEDO，型號： EL204)。

1.4 小鼠急性肝損傷模型的建立及分組

取昆明種小鼠60只，18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分為六組，每組10只。設(shè)正常對照組、模型對照組、救必應(yīng)水提液給藥組(低、中、高劑量組)、聯(lián)苯雙脂陽性對照組。救必應(yīng)水提液給藥低、中、高劑量組分別采用6g生藥·kg-1、4g生藥·kg-1、2g生藥·kg-1，正常對照組、模型對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予聯(lián)苯雙酯滴丸(0.2g·kg-1)，按20mL·kg-1灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥7天。第7天給藥后1h，正常對照組按10mL·kg-1腹腔注射生理鹽水，其他各組小鼠按10mL·kg-1腹腔注射D-氨基半乳糖(500mg·kg-1)。動物禁食不禁水， 24h后眼球取血，分離血清用于檢測ALT、AST活性。處死動物，取出肝組織，一半制成肝組織勻漿，檢測肝組織SOD活性及MDA含量，另1半固定于10%甲醛溶液中48h以上，常規(guī)石蠟包埋，切片并染色，顯微鏡下觀察病理改變并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 救必應(yīng)水提液對D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響

由表1可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性值較正常對照組明顯升高 (P<0.01)；救必應(yīng)水提液高、中、低劑量組，聯(lián)苯雙脂組ALT值均明顯低于模型組 (P<0.05)；救必應(yīng)水提液高、中劑量組，聯(lián)苯雙脂組AST值均明顯低于模型組 (P<0.01)，救必應(yīng)水提液低劑量組AST值也明顯低于模型組(P<0.05)，詳見表1。

組別劑量(g生藥/kg)ALT(U/L)AST(U/L)正常對照組-49.77±10.5698.16±9.93模型組-70.67±12.26**150.71±19.86**救必應(yīng)高劑量組656.27±13.44Δ110.00±16.48ΔΔ救必應(yīng)中劑量組458.35±12.85Δ115.19±16.02ΔΔ救必應(yīng)低劑量組260.73±7.61Δ128.53±15.08Δ聯(lián)苯雙脂組0.257.50±6.83Δ106.45±12.11ΔΔ

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

2.2 救必應(yīng)水提液對D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠肝臟MDA、SOD的影響

由表2可知，模型組肝組織MDA含量較正常對照組明顯升高 (P<0.01)；救必應(yīng)水提液高劑量組肝組織MDA含量明顯低于模型組 (P<0.01)， 救必應(yīng)水提液中劑量組肝組織MDA含量也明顯低于模型組 (P<0．05)；模型組，聯(lián)苯雙脂組肝組織SOD活性值較正常對照組明顯降低 (P<0.05)，救必應(yīng)水提液高、中劑量組，聯(lián)苯雙脂組肝組織SOD活性值均明顯高于模型組 (P<0.05)。

2.3 救必應(yīng)水提液對D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠肝組織病變的影響

正常對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰, 肝細(xì)胞排列較規(guī)則，呈放射狀排列。模型組小鼠肝細(xì)胞明顯水腫和空泡樣變性，細(xì)胞界限不清，肝細(xì)胞排列紊亂。 救必應(yīng)低劑量組小鼠肝細(xì)胞與模型組相似，可見較多肝細(xì)胞水腫和空泡樣變性，部分肝細(xì)胞核碎裂。救必應(yīng)中劑量組仍可見少量肝細(xì)胞水腫和空泡樣變性，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，排列不規(guī)則。救必應(yīng)高劑量組和聯(lián)苯雙脂組小鼠肝細(xì)胞變性壞死明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列較規(guī)則。具體見圖1。

組別劑量(g生藥/kg)MDA(nmol·mgprot-1)SOD(U·mL-1)正常對照組--5.92±0.84140.71±12.71模型組--11.12±1.27**125.38±12.39*救必應(yīng)高劑量組66.61±0.85ΔΔ142.90±15.10Δ救必應(yīng)中劑量組49.77±1.0Δ139.15±10.45Δ救必應(yīng)低劑量組211.01±1.42122.95±12.39聯(lián)苯雙脂組0.25.52±0.89ΔΔ143.53±13.69Δ

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

圖1 小鼠肝組織病理比較( HE，×400 )

3 討論

引起肝細(xì)胞損傷的致病因素不同，但導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死的機(jī)理大致相同。自由基與肝細(xì)胞損傷密切相關(guān)。病理情況下產(chǎn)生的過多自由基若得不到清除，會隨之產(chǎn)生一系列過氧化反應(yīng)，影響到細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、代謝甚至功能。D-氨基半乳糖是肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，進(jìn)入人體后可與磷酸尿苷結(jié)合，限制細(xì)胞器及酶的生成和補(bǔ)充，導(dǎo)致肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常[8]，可造成肝臟彌漫性變性、壞死及炎癥反應(yīng)，與臨床上急性普通型肝炎的病理變化類似。有研究發(fā)現(xiàn)， D-氨基半乳糖可通過誘生自由基從而引起肝損傷[9]。

ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶可進(jìn)入血液中，引起血清中ALT水平升高。AST也存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，并分布于線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷時，AST從線粒體內(nèi)釋放入血，可使血清AST水平升高[10]。SOD能催化清除超氧陰離子自由基，是重要的氧自由基清除劑[5]。MDA 是脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)物之一，如產(chǎn)生過多，可引起細(xì)胞代謝及功能障礙，可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，救必應(yīng)水提液在4g生藥·kg-1及以上劑量，具有較好的降低血清ALT、AST水平作用，并且可有效降低肝組織中MDA含量，增強(qiáng)肝組織SOD活性；救必應(yīng)水提液在6g生藥·kg-1以上劑量還能明顯減輕肝損傷模型小鼠肝細(xì)胞變性壞死情況，減輕病理損害。這些表明救必應(yīng)水提液具有明顯的降酶保肝作用，其抗肝損傷機(jī)制與抗脂質(zhì)過氧化的損傷密切相關(guān)。救必應(yīng)水提液通過對抗自由基活性，加速自由基清除，減少脂質(zhì)過氧化發(fā)生，從而減輕D-氨基半乳糖引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，降低血清轉(zhuǎn)氨酶。救必應(yīng)的保肝作用與抗氧化活性有關(guān)。

[1] 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局. 廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(第1冊)[S].廣州:廣東科學(xué)技術(shù)出版社,2004:172-173.

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Protective Effect of Water Extract of Ilex rotunda Thund on Experimental Liver Injury of Mice

Qiu Fen，Zhang Xingshen ， Jiang Haiyan，Liang Xinna ， Jin Zhao，Yan Shouxia

(Medicine College of Guangxi University of Chinese Medicine ，Nanning 530200，China)

Objective:To study the the efficiency of water extract of Ilex rotunda Thund on protection hepatocytes from acute injury in animal model.Methods:The acute hepatic injury model was made by by injection of D-aminogalactose to study the liver protection of water extract of Ilex rotunda Thund.Results:Elevated serum ALT,GST activity in D-aminogalactose liver injury model were reduced by water extract of Ilex rotunda Thund. Water extract of Ilex rotunda Thund reduced MDA level and incrseaed SOD activity in hepatocytes in D-aminogalactose liver injury model significantly. Conclusion:the liver protection of water extract of Ilex rotunda Thund is contected to the function of inhibitory effect of lipid peroxidation induced by D-aminogalactose.

Liver Injury; Cortex Ilicis Rotundae; Mice; Pathogenesis

2014-10-25

廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥民族醫(yī)藥自籌經(jīng)費(fèi)科研項(xiàng)目(gzzc1122)

丘芬(1981-),女，碩士，廣西中醫(yī)藥大學(xué)高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：kadylv@163.com

R285.5

A

1673-2197(2015)05-0010-02

10.11954/ytctyy.201505005