朱振標，張 壽，劉亦恒，金旭紅，林之斌

(?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，海南 ?？?570208)

膝骨關節(jié)炎關節(jié)液和滑膜中IL-18與MMP-13的表達及臨床意義

朱振標，張 壽，劉亦恒，金旭紅，林之斌

(海口市人民醫(yī)院骨科中心，海南 ?？?570208)

目的探討膝骨關節(jié)炎(KOA)患者的關節(jié)液和滑膜中白細胞介素(IL)-18與基質金屬蛋白酶(MMP)-13的表達及其臨床意義。方法選取2011年1月至2013年12月期間我院收治的76例KOA患者作為觀察組，76例患者中，輕度30例，中度26例，重度20例。所有受試者軟骨損傷分度為Ⅱ度26例，Ⅲ度28例，Ⅳ度22例；另選擇32例膝關節(jié)半月板損傷患者為對照組。檢測受試者膝關節(jié)關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13表達情況。結果觀察組患者的膝關節(jié)關節(jié)液和膝關節(jié)滑膜中的IL-18、MMP-13水平均高于對照組，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；隨著KOA程度的加重，關節(jié)液和滑膜中的IL-18、MMP-13水平呈上升趨勢，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；隨著KOA分度的增加，關節(jié)液和滑膜中的IL-18、MMP-13水平呈上升趨勢，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；關節(jié)液IL-18、MMP-13水平與滑膜IL-18、MMP-13水平分別呈正相關(r=0.361，0.371，P= 0.021，0.016)；關節(jié)液IL-18水平與關節(jié)液MMP-13水平呈正相關(r=0.369，P=0.019)；滑膜IL-18水平與滑膜MMP-13水平呈正相關(r=0.378，P=0.015)；關節(jié)液和滑膜中IL-18、MMP-13水平與KOA程度、KOA分度均呈正相關(P＜0.05)。結論MMP-13、IL-18在KOA關節(jié)液和滑膜中均高表達；兩者呈現(xiàn)出顯著正相關，共同在KOA的發(fā)病及病情進展中起作用。

骨性關節(jié)炎；白細胞介素；基質金屬蛋白酶；關節(jié)液；滑膜

膝骨關節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的一種，為一種慢性退行性骨關節(jié)病變，隨著人口老齡化程度的加劇，其發(fā)病有上升趨勢[1]。65歲以上人群KOA發(fā)病率高達50%以上，在美國，其發(fā)病僅次于心血管疾病，給社會及家庭帶來沉重負擔[2]。研究顯示，細胞因子、酶類與KOA的發(fā)病關系密切，在KOA進展過程中起重要作用[3-6]。白細胞介素(Interleukin，IL)為研究較多的細胞因子，在多種炎癥反應中起作用；基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)為近期研究熱點之一[7]。本研究通過檢測KOA關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13的水平，旨在探討IL-18、MMP-13在膝關節(jié)KOA中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2013年12月期間被我院骨科收治的76例KOA患者為觀察組，所有患者均符合KOA的診斷標準[1]?；颊吣挲g56～81歲，中位年齡51歲；體重指數(shù)(BMI)(22.58±3.27)kg/m2；男性36例，女性40例；左側37例，右側39例。依據(jù)綜合ISOA及K-L放射線分級標準[1]，76例患者中，輕度30例，中度26例，重度20例。對所有受試者行關節(jié)鏡檢查并對軟骨損傷分度[1]：Ⅱ度26例，Ⅲ度28例，Ⅳ度22例；另選擇同期被我院骨科收治的32例膝關節(jié)半月板損傷患者為對照組，患者年齡57～85歲，中位年齡52歲；左側16例，右側16例。四組受試者的年齡、性別、吸煙狀況和BMI比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。所有受試者均知情并簽署知情同意書。本研究已通過我院倫理委員會審核批準。

表1 四組受試者的基本資料比較(±s)

表1 四組受試者的基本資料比較(±s)

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1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準[1]符合相關疾病的診斷標準；近1個月內(nèi)未注射過激素類藥物；無嚴重肝腎疾??；無其他嚴重腦部器質性病變；依從性佳；知情同意。

1.2.2 排除標準[1]骨腫瘤者；風濕性關節(jié)炎患者；類風濕性關節(jié)炎者；膝關節(jié)嚴重感染者；有其他嚴重精神疾病者；有酒精藥物濫用史；1周內(nèi)應用非甾體類藥物者；不配合接受臨床檢查者；不愿意接受治療者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 于關節(jié)鏡檢查時收集受試者關節(jié)液、滑膜標本，術中用注射器抽取關節(jié)囊中關節(jié)液3 ml，注入離心管保存。切取關節(jié)滑膜組織放入標本袋保存。將存放關節(jié)液的離心管1 500 g/min，離心15 min，將上清液吸進EP管，于-80°C保存待測。用生理鹽水多次沖洗滑膜組織，用刀片切成小塊，用4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋待測。

1.3.2 關節(jié)液、滑膜組織IL-18、MMP-13檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測關節(jié)液IL-18、MMP-13含量，試劑盒購自于上海華大科技有限公司，嚴格按照說明書操作[6]。滑膜標本切片行HE染色，使用免疫組化SP法檢測滑膜組織IL-18、MMP-13的表達情況。采用Image Pro-Plus 6.0檢測分析免疫組化結果，分析滑膜組織IL-18、MMP-13表達的積分光密度(IOD)。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者的關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比較 觀察組膝關節(jié)關節(jié)液IL-18、MMP-13水平均高于對照組，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；觀察組膝關節(jié)滑膜IL-18、MMP-13水平均高于對照組，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表2。

表2 兩組受試者的關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比較(±s)

表2 兩組受試者的關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比較(±s)

觀察組(n=76)對照組(n=32) 142.61±20.16 38.29±6.71 219.61±22.81 35.62±7.21 143.58±12.61 100.29±8.78 149.28±15.61 96.29±10.57 t值P值關節(jié)液IL-18 (pg/ml) 7.0182 0.0000關節(jié)液MMP-13 (ng/ml) 8.9639 0.0000滑膜IL-18 (IOD) 6.0872 0.0001滑膜MMP-13 (IOD) 6.8728 0.0000

2.2 四組受試者膝關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平 四組受試者膝關節(jié)液、滑膜IL-18、MMP-13水平比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；隨著 KOA程度的加重，關節(jié)液IL-18、MMP-13水平呈上升趨勢(P＜0.01)；隨著KOA程度的加重，滑膜IL-18、MMP-13水平也呈上升趨勢(P＜0.01)，見表3。

2.3 四組受試者膝關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平 四組受試者膝關節(jié)液、滑膜IL-18、MMP-13水平比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；隨著KOA分度的增加，關節(jié)液IL-18、MMP-13水平呈上升趨勢(P＜0.01)；隨著KOA分度的增加，滑膜IL-18、MMP-13水平也呈上升趨勢(P＜0.01)，見表4。

表3 四組受試者膝關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比較(±s)

表3 四組受試者膝關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比較(±s)

組別重度組(n=20)中度組(n=26)輕度組(n=30)對照組(n=32) F值P值關節(jié)液IL-18(ng/ml) 149.61±28.27 136.29±21.56 130.08±11.21 38.29±6.71 6.7219 0.0000關節(jié)液MMP-13(pg/ml) 287.62±35.89 201.62±29.28 181.76±12.71 35.62±7.21 7.8062 0.0000滑膜IL-18(IOD) 150.72±27.81 141.56±22.92 126.21±11.02 100.29±8.78 7.9868 0.0000滑膜MMP-13(IOD) 288.67±36.81 202.58±26.97 178.98±12.53 96.29±10.57 7.2737 0.0000

表4 四組受試者膝關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比較(±s)

組別對照組(n=32)Ⅱ度(n=26)Ⅲ度(n=28)Ⅳ度(n=22) F值P值關節(jié)液IL-18(ng/ml) 38.29±6.71 128.16±9.16 135.37±20.35 152.53±29.32 6.3782 0.0000關節(jié)液MMP-13(pg/ml) 35.62±7.21 178.29±19.37 204.91±30.12 290.71±36.91 7.3721 0.0000滑膜IL-18(IOD) 100.29±8.78 125.39±9.09 142.72±23.31 152.78±27.92 7.8981 0.0000滑膜MMP-13(IOD) 96.29±10.57 176.26±4.49 201.62±26.78 292.75±36.93 7.2637 0.0000

2.4 IL-18、MMP-13與年齡、KOA程度、KOA分度、吸煙狀況、BMI的相關性 對KOA關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平與年齡、KOA程度、KOA分度、吸煙狀況、BMI等因素進行相關性分析，結果顯示，關節(jié)液IL-18、MMP-13水平與滑膜IL-18、MMP-13水平分別呈正相關(r=0.361，0.371，P= 0.021，0.016)；關節(jié)液IL-18水平與關節(jié)液MMP-13水平呈正相關(r=0.369，P=0.019)；滑膜IL-18水平與滑膜MMP-13水平呈正相關(r=0.378，P=0.015)；關節(jié)液、滑膜中IL-18、MMP-13水平與KOA程度、KOA分度均呈正相關(P＜0.05)，而與年齡、吸煙狀況、BMI等因素無明顯相關性，見表5。

表5 IL-18、MMP-13與年齡、KOA程度、KOA分度、吸煙狀況、BMI的相關性

3 討論

KOA為退行性病變，發(fā)病原因復雜，與多種因素相關；老齡、遺傳、內(nèi)分泌紊亂均可引發(fā)KOA[8]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，IL、MMP亦參與了KOA的發(fā)病，在其發(fā)病機制中起重要作用[9-15]。Ravi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，和正常人群比較，IL家族在KOA患者中可異常表達。本研究顯示，KOA患者關節(jié)液、滑膜中IL-18水平明顯高于非KOA組患者。表明IL家族成員之一IL-18在KOA中亦起重要作用，IL-18具有促軟骨細胞分解代謝的作用。研究發(fā)現(xiàn)IL-18可通過激活蛋白-1促進KOA滑膜增生，且IL-18表達水平與KOA嚴重程度相關[10]。本研究亦顯示，隨著KOA程度和分度的增加，滑膜IL-18、MMP-13的表達呈增強趨勢。提示IL-18不僅在KOA發(fā)病中起重要作用，其表達與KOA的嚴重程度及病情進展亦呈現(xiàn)出正相關的趨勢。IL-18作為精細調節(jié)因子，可促軟骨細胞分解代謝，增強關節(jié)炎癥、促進關節(jié)軟骨退變，進而導致KOA的發(fā)病[1]。

MMP家族(MMPs)為一種重要酶類，可有效降解軟骨中細胞外基質；MMP-13為MMPs一員，可對各種膠原進行有效降解，可分解膠原三螺旋結構[16]。Bozic等[4]研究發(fā)現(xiàn)，OA患者關節(jié)液中MMPs表達明顯較正常人群不同。Hauser等[6]亦發(fā)現(xiàn)，OA患者滑膜中存在MMPs過量表達現(xiàn)象，MMPs可能在OA發(fā)病及滑膜增生過程中起重要作用。本研究通過免疫組化方法檢測滑膜組織中MMP-13的表達，通過ELISA方法檢測關節(jié)液中該酶類的含量，檢測顯示，KOA患者關節(jié)液、滑膜中MMP-13表達強度明顯高于非OA者，與文獻報道基本一致。提示MMP-13參與了KOA的發(fā)病，且與滑膜增生密切相關。Kneer等[1]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-13在OA關節(jié)軟骨損害中起一定的作用，通過免疫組化方法可以檢測到MMP-13在OA組織中存在高表達現(xiàn)象，且MMP-13表達水平與OA嚴重程度相關。本研究亦顯示，重度KOA患者關節(jié)液、滑膜MMP-13檢測含量明顯高于中度和輕度患者，隨著KOA嚴重程度和分度的增加，關節(jié)液、滑膜MMP-13表達呈增強趨勢。表明MMP-13不僅在KOA發(fā)病中起重要作用，且其表達狀況與KOA的嚴重程度及病情進展亦呈現(xiàn)出明顯的相關性。生理情況下MMP-13表達低，而在KOA等病理狀況下，軟骨細胞釋放的MMP-13含量上升，可引起軟骨細胞外基質降解，進而導致軟骨細胞外架構受損，引起軟骨細胞和軟骨組織受損，軟骨細胞顯露于炎性環(huán)境中并進一步遭到破壞，引發(fā)KOA，其中，MMP-13的高表達在KOA的發(fā)病中起重要作用[17]。

MMPs以組織特異性的方式合成，其表達受細胞因子、激素等因素調節(jié)，MMPs在正常人群中表達極低，但在OA等病理情況下可高表達[18]。本研究中KOA關節(jié)液中MMP-13、IL-18含量明顯高于對照組，且關節(jié)液中MMP-13、IL-18水平呈現(xiàn)出明顯的正相關。在研究中我們通過免疫組化方法檢測關節(jié)滑膜組織中MMP-13、IL-18的表達情況，檢測結果顯示，KOA滑膜組織中MMP-13、IL-18表達強度明顯強于正常對照組，且滑膜組織中MMP-13、IL-18的表達之間呈現(xiàn)出顯著正相關。表明MMP-13、IL-18兩者共同參與了KOA的發(fā)病及進展，兩者相互作用，導致KOA關節(jié)受損并發(fā)病，但MMP-13、IL-18調控KOA發(fā)病的具體過程仍然需要更加深入的基礎研究驗證。

本研究不足之處是入組對象較少、規(guī)模較小，因此在一定程度上可能影響研究的結果和精確性。因此，仍然需要更大規(guī)模的臨床研究進一步驗證。MMP-13、IL-18在KOA關節(jié)液、滑膜中均高表達；兩者呈現(xiàn)出顯著正相關，共同在KOA的發(fā)病及病情進展中起作用。

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Expression and clinical significance of IL-18 and MMP-13 in synovial and joint fluid in knee osteoarthritis.

ZHU Zhen-biao,ZHANG Shou,LIU Yi-heng,JIN Xu-hong,LIN Zhi-bin.
Department of Orthopaedics,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study expression and clinical significance of IL-18 and MMP-13 in synovial and joint fluid in knee osteoarthritis(KOA).MethodsFrom January 2011 to December 2011,76 patients of KOAadmitted in our hospital were selected as observation group,including 30 mild cases,26 moderate cases and 20 severe cases.According to the cartilage damage degree,the patients were divided into 26 cases ofⅡdegree,28 cases ofⅢdegree,and 22 cases ofⅣdegree.Thirty-two patients of knee joint meniscus injury were selected as the control group.The expression levels of IL-18,MMP-13 in synovial and joint fluid in knee joint of patients were tested.ResultsThe levels of IL-18, MMP-13 in synovial and joint fluid in knee joint were significantly higher in the observation group than the control group (P＜0.01).As the degree of the KOA was aggravating,IL-18,MMP-13 levels in synovial and joint fluid were on the rise, and there was statistically significant difference(P＜0.01).With the increase of KOAdividing,IL-18,MMP-13 levels in synovial and joint fluid were on the rise,and there was statistically significant difference(P＜0.01).The levels of IL-18, MMP-13 in joint fluid were positively correlated with those in synovial fluid(r=0.361,0.371,P=0.021,0.016).IL-18 level of joint fluid had positive correlation with MMP-13 level of joint fluid(r=0.369,P=0.019),and synovial IL-18 and synovial MMP-13 levels were positively related(r=0.378,P=0.378).In joint fluid,synovial IL-18,MMP-13 levels showed a positive correlation with the degree of the KOA,KOA dividing(P＜0.05).ConclusionMMP-13,IL-18 are highly expressed in the synovial and joint fluid of KOA,and there is a significant positive correlation between the two,which play a role in the pathogenesis of KOA.

Osteoarthritis;Interleukin;Matrix metalloproteinases;Joint fluid;Synovial

R684.3

A

1003—6350（2015）15—2227—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0804

2014-12-11)

張 壽。E-mail：bong1976@163.com