王 月，王明潔，常 悅，崔淑霞

1)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052 2)河南省口腔醫(yī)院正畸科 鄭州 450052

牙周病大鼠正畸源性牙根吸收和MMP-9表達(dá)的觀察*

王 月1)，王明潔1)，常 悅1)，崔淑霞2)#

1)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052 2)河南省口腔醫(yī)院正畸科 鄭州 450052

#通信作者，女，1968年1月生，碩士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：口腔正畸，E-mail：cui-shuxia@163.com

牙根吸收；基質(zhì)金屬蛋白酶9；牙周病;大鼠；正畸

目的：探討牙周病大鼠不同正畸條件下牙根吸收情況與牙組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)水平的變化。方法：取108只大鼠,54只制作大鼠牙周病模型，模型制備成功后分別給予0、50和80 g正畸力牽拉1、7、14 d，每個(gè)條件下6只大鼠;另54只給予相同正畸處理但不制備牙周病模型(對(duì)照組)。以上頜切牙為支抗，分別牽拉左側(cè)上頜第一磨牙向近中移動(dòng)。取各組大鼠實(shí)驗(yàn)牙制作組織切片，觀察牙根吸收情況，應(yīng)用免疫組化染色觀察MMP-9的表達(dá)。結(jié)果：50或80 g正畸力牽拉7 d后，兩組大鼠牙周膜均排列紊亂，可見(jiàn)明顯的牙根吸收現(xiàn)象，牙周病組大鼠牙根吸收情況較對(duì)照組嚴(yán)重；牽拉14 d后牙根吸收活動(dòng)基本停止。隨著正畸力的增加，MMP-9表達(dá)水平逐漸升高；牽拉7 d后MMP-9表達(dá)水平最高，14 d后下降；牙周病組牙組織中MMP-9表達(dá)水平高于對(duì)照組(F組別=3.031,P=0.022;F正畸力=6.634,P=0.014;F時(shí)間=4.820,P=0.009;F交互=0.890,P=0.514)。結(jié)論：牙組織中MMP-9表達(dá)水平可能能反映牙周病大鼠牙根吸收的程度。

牙根吸收是臨床正畸治療中常見(jiàn)的并發(fā)癥，目前對(duì)于牙根吸收的早期診斷和治療方法非常有限，因此,探究出一種能夠早期發(fā)現(xiàn)牙根吸收的檢測(cè)指標(biāo)具有重要的臨床意義?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是在結(jié)構(gòu)和功能上同源的一組蛋白酶超基因家族，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重建過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1],是參與牙周組織改建的主要酶類(lèi)，可能與牙根吸收有關(guān)。作者給予牙周病模型大鼠不同條件下的正畸處理，觀察牙根吸收情況及實(shí)驗(yàn)牙中MMP-9表達(dá)的變化，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠108只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，6～7周齡，體重260～280 g，分籠飼養(yǎng)，水與飼料供給充足，實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 牙周病模型的制備方法 按3.3 mg/kg的劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，用橡皮筋將大鼠頭部固定在鼠板上，用拉鉤器拉開(kāi)口角，暴露并探針剝離上頜第一磨牙，用結(jié)扎絲穿引1周后結(jié)扎，使結(jié)扎絲陷于牙齦內(nèi)。喂養(yǎng)高糖飼料以及100 g/L蔗糖水。每天檢查結(jié)扎絲一次，有脫落者及時(shí)重新結(jié)扎，2周后進(jìn)行牙周檢查[2]。結(jié)扎絲去除后上頜第一磨牙牙齦顏色變深，齦乳頭水腫，探診后出血或有較淺的牙周袋，表明牙周病模型制備成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 108只大鼠中,54只制作大鼠牙周病模型，模型制備成功后分別給予0、50和80 g正畸力牽拉1、7、14 d，每個(gè)條件下6只大鼠;另54只給予相同正畸處理但不制備牙周病模型(對(duì)照組)。正畸處理：以上頜切牙為支抗，在大鼠上頜切牙和左側(cè)第一磨牙間放置NiTi拉簧，將0.25NiTi絲固定于上頜切牙牙頸部(上頜切牙牙頸部用牙科渦輪機(jī)打磨出深1 mm的槽溝以方便固定)，牽拉上頜左側(cè)第一磨牙向近中移動(dòng)，每日檢查加力裝置是否脫落和力值是否衰減。

1.4 牙根吸收情況的觀察 處死大鼠,解剖取出上頜左側(cè)第一磨牙及其周?chē)啦酃?，固定、脫鈣、包埋、切片后進(jìn)行HE染色，觀察牙根吸收情況。

1.5 MMP-9的檢測(cè) 將大鼠左側(cè)上頜第一磨牙組織切片做免疫組化SP法染色[3]，采用 Olympus 光學(xué)顯微鏡在高倍視野下由對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組不知情的醫(yī)師讀片、觀察，進(jìn)行圖像采集，計(jì)算陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度值，以此表示MMP-9表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，大鼠牙組織中MMP-9表達(dá)水平的比較采用2×3×3析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 正畸力為0 g時(shí)，對(duì)照組大鼠牙根表面牙骨質(zhì)層光滑、完整，牙周膜纖維排列整齊；牙周病組大鼠左側(cè)上頜第一磨牙近中根近中側(cè)根尖區(qū)牙周膜纖維排列不規(guī)則，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但牙骨質(zhì)周?chē)匆?jiàn)吸收陷窩。用50或80 g正畸力牽拉1 d后，對(duì)照組未見(jiàn)明顯異常，牙周病組大鼠牙骨質(zhì)周?chē)梢?jiàn)炎性細(xì)胞密集，但是未見(jiàn)明顯的吸收陷窩；牽拉7 d后，兩組大鼠牙周膜均排列紊亂，牙根邊緣可見(jiàn)明顯的牙根吸收現(xiàn)象，牙骨質(zhì)周?chē)霈F(xiàn)大小不一的多個(gè)吸收陷窩，牙根吸收活動(dòng)達(dá)到頂峰，牙周病組大鼠牙根吸收情況較對(duì)照組嚴(yán)重；牽拉14 d后，兩組大鼠牙骨質(zhì)周?chē)障莞C數(shù)量并未較7 d時(shí)明顯增加，有些吸收陷窩內(nèi)出現(xiàn)了修復(fù)性牙本質(zhì)，牙根吸收活動(dòng)基本停止(圖1)。

2.2 MMP-9的表達(dá) 見(jiàn)圖2、表1。

圖1 組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE,×200)

圖2 實(shí)驗(yàn)牙組織中MMP-9的表達(dá)(SP，×200)

A：對(duì)照組大鼠0 g正畸力牽拉1 d；B:牙周病組大鼠0 g正畸力牽拉1 d;C：對(duì)照組大鼠80 g正畸力牽拉7 d；D：牙周病組大鼠80 g正畸力牽拉7 d；E：對(duì)照組大鼠50 g正畸力牽拉14 d；F：牙周病組大鼠50 g正畸力牽拉14 d。

表1 大鼠左側(cè)上頜第一磨牙(實(shí)驗(yàn)牙)組織中MMP-9的表達(dá) (n=6)

F組別=3.031,P=0.022;F正畸力=6.634,P=0.014;F時(shí)間=4.820,P=0.009;F交互=0.890,P=0.514。

3 討論

牙根吸收是正畸過(guò)程中不可避免的并發(fā)癥，它開(kāi)始于正畸早期，并將會(huì)伴隨著整個(gè)正畸過(guò)程，目前所有的檢查手段都很難發(fā)現(xiàn)并確證正畸早期發(fā)生的牙根吸收。King等[4]以上頜切牙為支抗，使用NiTi拉簧牽拉磨牙向近中移動(dòng)，發(fā)現(xiàn)30～40 g正畸力可以達(dá)到移動(dòng)牙齒的同時(shí)不造成牙根吸收的目的。盧燕勤等[5]的研究表明，對(duì)大鼠磨牙施以50～80 g正畸力會(huì)造成一定的牙根吸收，且力值越大，牙根吸收情況越嚴(yán)重。由于該實(shí)驗(yàn)旨在研究牙根吸收，所以實(shí)驗(yàn)中選擇50 g和80 g兩個(gè)力值。結(jié)果顯示，用50或80 g正畸力牽拉7 d后，兩組大鼠牙周膜均排列紊亂，牙根邊緣可見(jiàn)明顯的牙根吸收現(xiàn)象，牙骨質(zhì)周?chē)霈F(xiàn)大小不一的多個(gè)吸收陷窩，牙根吸收活動(dòng)達(dá)到頂峰，牙周病組大鼠牙根吸收情況較對(duì)照組嚴(yán)重；牽拉14 d后牙根吸收活動(dòng)情況并未較牽拉7 d時(shí)加重，牙根吸收活動(dòng)基本停止。

MMP-9具有切斷細(xì)胞外基質(zhì)成分,調(diào)節(jié)細(xì)胞黏著并間接參與組織再塑和創(chuàng)傷修復(fù)等生理功能，是基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶[6]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著正畸力的增加，牙周病組和對(duì)照組大鼠牙組織中MMP-9表達(dá)水平也越來(lái)越高，與Balducci等[7]的研究結(jié)果一致。在相同的正畸條件下，兩組在牽拉7 d后MMP-9表達(dá)水平最高，牽拉14 d后其表達(dá)反而下降，與組織形態(tài)學(xué)觀察到的牙根吸收嚴(yán)重程度的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明牙組織中MMP-9表達(dá)水平可以作為衡量牙根吸收嚴(yán)重程度的指標(biāo)。同時(shí)，牙周病組大鼠牙組織中MMP-9表達(dá)水平均高于對(duì)照組。在大鼠磨牙正畸過(guò)程中，牙周組織受力可引起成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的MMPs明顯增多，作為裂解片段之一的MMP-9亦被大量釋放到牙周組織中，在組織中有所表達(dá)[8]。正畸牽拉后的第7天是酶形成和聚積階段, 故此時(shí)期牙組織中MMP-9表達(dá)水平也最高，牽拉后的第14天可能為酶的消耗階段，因此牙組織中MMP-9表達(dá)水平下降，這與趙紅宇等[8]研究得出的結(jié)果MMPs蛋白在牙周病的發(fā)生中起重要作用相一致。

綜上所述，MMP-9表達(dá)水平的變化與牙根吸收的演變過(guò)程相一致。目前，X線是檢查牙根吸收的重要手段，但是X線結(jié)果具有一定的滯后性，只能在牙根吸收發(fā)生后的5～6個(gè)月才能確診，尤其是牙周病患者需要早期、多次檢查牙根情況，因此MMP-9表達(dá)水平檢測(cè)有可能有助于牙根吸收的早期判斷。但是該實(shí)驗(yàn)樣本量較小,對(duì)于MMP-9與牙根吸收的關(guān)系只能做一個(gè)初步的了解，研究結(jié)果為以后通過(guò)分子生物學(xué)的方法早期診斷并監(jiān)測(cè)牙根吸收提供了理論依據(jù)。

[1]王智，靳淑梅，張君．牙根吸收的原因與機(jī)制[J]．國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，37(1)：101

[2]蘇軍,劉魯川,毛永利等.SD 大鼠牙周炎動(dòng)物模型的建立[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2006,16(11)：612

[3]趙紅宇，張淼，岳新新，等.侵襲性牙周炎患者牙齦組織中MMP-1、MMP-8、MMP-13蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014,49(2):227

[4]King GJ,Keeling SD,McCoy EA,et al.Measuring dental drift and orthodontic tooth movement in resoponse to various initial forces in adult rats[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop,1991,99(5):456

[5]盧燕勤，張素銀，任力鋒，等.正畸大鼠磨牙牙周膜內(nèi)破骨細(xì)胞的出現(xiàn)與應(yīng)力的關(guān)系[J].口腔醫(yī)學(xué)縱橫,2001,17(2):116

[6]Delaissé JM,Dalaisse JM,Engsig MT,Everts V,et al.Proteinases in bone resorption obvious and less obvious roles[J].Clin Chim Acta,2000,291(2):223

[7]Balducci K,Ramachandran A,HAO J,et al.Biological makers for evaluation of root resorption[J].Arch Oral Biol,2007,52(3):203

[8]李永明,林珠,馮雪,等.MMP-2和TIMP-1在正畸牙周組織改建過(guò)程中的表達(dá)[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué),2000,16(6):417

(2015-01-09 收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expression of MMP-9 and root resorption by orthodontic force in rats with periodontal disease

WANGYue1),WANGMingjie1),CHANGYue1),CUIShuxia2)

1)SchoolofStomatology，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofOrthodontics,StomatologyHospitalofHenanProvince，Zhengzhou450052

root resorption;MMP-9;periodontal disease;rat;orthodontic

Aim: To investigate the expression of MMP-9 and root resorption by orthodontic force in rats with periodontal disease. Methods: A total of 108 rats were collected,among which 54 rats were made periodontal disease model,and then giving 0,50 or 80 g orthodontic force for 1,7,14 days,respectively,6 rats at each orthodontic condition;the other 54 rats(the control) were healthy and recepted the same orthodontic treatment. The histological slices of maxillary first molar were made to observe the histological changes of the root resorption and immunohistologic staining method was used to detect the expression of MMP-9.Results: When being loaded orthodontic force of 50 or 80 g for 7 days, the rats in the 2 groups showed that periodontal ligament arranged in disorder, obvious root resorption, and the root resorption of the periodontal disease rats was more severe than the control; after 14 days,root absorption activities stopped. With the increase of orthodontic force, the expression of MMP-9 increased; the expression of MMP-9 on the 7th day was the highest, and decreased after the 14th day; the expression of MMP-9 in periodontal disease group was higher than that in the control(Fgroup=3.031,P=0.022;Fforce=6.634,P=0.014;Ftime=4.820,P=0.009;Finteraction=0.890,P=0.514).Conclusion: The expression of MMP-9 in tooth tissue may reflect the severity of root resorption of periodontal disease rats.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.019

*河南省教育廳科技攻關(guān)項(xiàng)目 132300410050

R783.5