李 毅，劉冠磊，唐豪杰，張 寶，袁洪濤，許建中，李廣恒

鄭州大學第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

BMP4、VEGF、sFlt1多基因逆轉錄病毒轉染肌源性細胞對小鼠體內成骨過程的影響*

李 毅，劉冠磊，唐豪杰，張 寶，袁洪濤，許建中#，李廣恒#

鄭州大學第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

#通信作者:李廣恒，男，1973年6月生，博士，教授，研究方向：骨與軟骨再生，E-mail：liguangheng@hotmail.com；許建中，男，1964年9月生，博士，教授，研究方向：關節(jié)與運動醫(yī)學，E-mail:13937133786@163.com

肌源性細胞；基因治療；骨形態(tài)發(fā)生蛋白4；血管內皮生長因子；小鼠

目的：研究以肌源性細胞為基礎的BMP4、VEGF、sFlt1多基因治療在小鼠體內對成骨過程的影響。方法：分別以2種肌源性細胞C2C12 和PM為細胞載體，用BMP4、VEGF、sFlt1逆轉錄病毒進行重復轉染。2種肌源性細胞分別重復轉染后，產生6組實驗細胞，分別是C2C12-B-sFlt1、C2C12-B、C2C12-B-VEGF、PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF。6組細胞在體外復合明膠海綿后分別植入小鼠的股肌袋內。術后不同時間應用組織學、X線檢查觀察各組的成骨量以及軟骨化骨的組織學演變過程。結果：C2C12-B-sFlt1和C2C12-B 2組細胞在體內可引發(fā)軟骨化骨過程，2組的成骨量在特定的時間段內無明顯區(qū)別，但X線檢查顯示2組的成骨空間方向不盡相同。C2C12-B-VEGF在體內沒有誘發(fā)軟骨化骨的過程，其所誘發(fā)的組織學過程類似血管瘤。PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF 3組細胞在體內誘發(fā)軟骨化骨的過程較為類似，3組的成骨量在35 d的觀察期內無明顯區(qū)別。結論：骨骼肌源性細胞可作為BMP4基因治療的基礎細胞，而在增加了VEGF 和sFlt1基因的復合基因轉染后，其軟骨化骨的表現(xiàn)具有細胞種群的特異性。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)植入骨骼肌后可誘導產生異位軟骨化骨，該過程的細胞分化機制為BMP誘導骨骼肌內的肌源性細胞向成骨細胞分化，隨后血管內皮細胞趨化、積聚導致新生血管形成，從而在特定的時間內形成異位骨化[1-2]?；谠摶A研究而發(fā)展起來的以骨骼肌源性細胞為基礎的成骨基因治療也逐漸成為骨組織工程領域的研究重點[3]。該研究中采用多基因的逆轉錄病毒轉染技術，觀察肌源性細胞在促進骨形成基因BMP4和血管形成基因血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)以及VEGF受體拮抗劑soluble fms-like tyrosine kinase-1(sFlt-1)的共同作用下其成骨過程的變化。

1 材料與方法

1.1 細胞 C2C12 細胞購買于美國ATCC公司。PM細胞為應用多酶解技術從C57BL6J小鼠的股四頭肌內分離出來的肌源性細胞[4]。2種細胞都在含有體積分數(shù)10%胎牛血清、體積分數(shù)10%馬血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)的條件是體積分數(shù)5%CO2、37 ℃。細胞培養(yǎng)液2～3 d更換1次。細胞在約50%融合時開始傳代。

1.2 實驗動物 C57BL6J小鼠作為分離出原代肌源性細胞的宿主。SCID 小鼠作為各組細胞植入股肌袋內完成體內實驗的小鼠。所有的動物實驗都經鄭州大學倫理委員會批準。

1.3 裝載BMP4、VEGF、sFlt1逆轉錄病毒載體的構建 裝載人BMP4基因質粒(pCLBMP4)、VEGF165 cDNA(pCLVEGF)、sFlt1基因的逆轉錄病毒載體的制備是應用經典三質粒共同轉染293包裝細胞，收集得到純化的上清液[5]。根據(jù)上述方法得到的3種病毒分別表示為裝載人BMP4基因的逆轉錄病毒載體(Retro-BMP4)、裝載人VEGF165基因的逆轉錄病毒載體(Retro-VEGF)、裝載sFlt-1基因的逆轉錄病毒載體(Retro-sFlt1)。

1.4 病毒細胞轉染 分別在體外培養(yǎng)細胞至50%融合時，從細胞培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)液，PBS清洗之后加入10 mL Retro-BMP4的病毒懸液(1×109～5×109cfu/L)和10 mL的含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM以及溴化己二甲銨(8 mg/L)，每隔16 h更換1次病毒懸液，3次共48 h完成病毒轉染。C2C12-BMP4(轉染過Retro-BMP4的C2C12細胞，C2C12-B)作為C2C12細胞組中的一個亞組。在C2C12-BMP4細胞的基礎上再次分別應用Retro-VEGF和Retro-sFlt1進行病毒轉染。按上述辦法轉染小鼠原代分離培養(yǎng)的肌源性細胞。經過這樣的病毒轉染共產生6組細胞，分別為C2C12-B-sFlt1、C2C12-B、C2C12-B-VEGF、PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF細胞組。這6組細胞產生后，分別應用相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并應用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒進行分泌蛋白檢測，以確定細胞轉染的有效性。

1.5 細胞植入小鼠體內 6組細胞在體外培養(yǎng)達到一定數(shù)目的時候，分別經胰蛋白酶消化，取100 μL含2×105個細胞的懸液滴入預先制備的6 mm×6 mm大小的無菌明膠海綿塊上，然后將吸附有病毒的明膠海綿通過切開植入的方法植入SCID 小鼠的股肌袋內，并在術后的第7、10、14、20、27、35天對植入物進行各項檢查。

1.6 X線放射學和新形成軟骨、骨的組織學檢查及鏡下定量分析 所有經細胞植入的小鼠在術后第28天于麻醉下進行X線檢查。部分PM細胞組的植入小鼠在術后6個月時也進行X線檢查。分別在術后第7、10、14、20、27、35天處死小鼠，采集標本進行組織學檢查，每個時間點每組小鼠采集3個標本。采集后的標本經快速冰凍切片，然后行Alcian藍/伊紅染色和Von Kossa/伊紅染色并進行觀察。Alcian藍/伊紅染色用于軟骨組織的染色，正常的軟骨組織在該染色的作用下為藍色。Von Kossa/伊紅用于骨組織的染色，正常的骨組織在該染色的作用下為黑色。應用Northern Eclipse成像系統(tǒng)對標本進行拍照，每個標本選擇5張全景的組織學染色的片子(放大10倍)進行骨和軟骨組織的定量分析。

2 結果

2.1 逆轉錄病毒轉染2種細胞的有效性 6組轉染過的細胞上清液中都檢測出了對應蛋白質的存在，而未轉染的細胞上清液中未檢測到對應蛋白質。

2.2 植入體內的3組C2C12細胞的組織學特點 3組C2C12細胞(C2C12-B、C2C12-B-VEGF、C2C12-B-sFlt1)表現(xiàn)出不太相同的成骨特點。C2C12-B-VEGF細胞組的表現(xiàn)較為特殊，該組在植入術后的任何觀察時間段均未見骨組織的形成；在觀察的后期，即術后第27和35天可見該組在體內形成的組織具有多個管腔，管腔內有大量的紅細胞，形成的整個組織具有類似血管瘤的組織學特點(圖1)。經Alcian藍/伊紅染色后，C2C12-B組呈現(xiàn)出較為正常的軟骨化骨過程，軟骨組織在植入術后的第7～10天出現(xiàn)，第14天消失。C2C12-B-sFlt1組則表現(xiàn)出軟骨化骨過程的異常，該組軟骨組織在植入術后的第7～10天出現(xiàn)，14 d后消失，但術后第27天再次出現(xiàn)，并在第35天也可見到軟骨組織。C2C12-B-VEGF組則未表現(xiàn)出軟骨化骨的過程(圖2)。

2.3 植入體內的3組PM細胞的組織學特點 3組PM細胞(PM-B、PM-B-VEGF、PM-B-sFlt1)表現(xiàn)出類似的成骨特點。骨組織在第10天左右出現(xiàn)，隨著時間的推移逐漸增多(圖3)。Alcian藍/伊紅染色后，3組細胞呈現(xiàn)出較為類似的軟骨化骨的過程，軟骨組織在植入術后的第7～10天出現(xiàn)，第14天消失(圖4)。

2.4 不同細胞組植入股肌袋內術后的X線檢查 術后第28天X線檢查顯示，C2C12-B-sFlt1和C2C12-B植入的小鼠股肌袋中均可見新生骨的形成，而C2C12-B-VEGF組未見任何新生骨組織(圖5a)。3組PM細胞術后第28天的X線檢查表現(xiàn)類似，在小鼠的股肌袋內均可見新生的骨組織形成(圖5b)。然而術后6個月的X線檢查顯示PM-B-sFlt1組的成骨量明顯多于PM-B和PM-B-VEGF組(圖5b)。

2.5 6組細胞植入小鼠體內形成的新生骨與軟骨組織的定量分析 C2C12-B-sFlt1和C2C12-B組的成骨和軟骨量類似，而C2C12-B-VEGF組無骨組織形成;3組PM細胞在35 d的觀察期內成骨和成軟骨量類似(圖6)。

圖1 3組C2C12細胞植入小鼠股肌袋內不同時間點的成骨組織學觀察結果(Von Kossa/伊紅染色，×400)

A組：C2C12-B-sFlt1細胞組； B組：C2C12-B細胞組；C組：C2C12-B-VEGF細胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中黑色為陽性骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、血管等。

圖2 3組C2C12細胞植入小鼠股肌袋內不同時間點的成軟骨組織學觀察結果(Alcian藍/伊紅染色，×400)

A組：C2C12-B-sFlt1細胞組；B組：C2C12-B細胞組；C組：C2C12-B-VEGF 細胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中藍色為陽性軟骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、血管等。

圖3 3組PM細胞植入小鼠股肌袋內不同時間點的成骨組織學觀察結果(Von Kossa/伊紅染色，×400)

A組：PM-B-sFlt1細胞組；B組：PM-B細胞組；C組：PM-B-VEGF 細胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中黑色為陽性骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、血管等。

圖4 3組PM細胞植入小鼠股肌袋內不同時間點的成軟骨組織學觀察結果(Alcian藍/伊紅染色，×400)

A組：PM-B-sFlt1細胞組；B組：PM-B細胞組；C組：PM-B-VEGF細胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中藍色為陽性軟骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、肌纖維和血管等。

圖5 6組細胞植入股肌袋內術后的X線檢查結果

a：3組C2C12細胞植入小鼠股肌袋內第28天的X線檢查結果。A組：C2C12-B-sFlt1細胞組；B組：C2C12-B細胞組；C組：C2C12-B-VEGF 細胞組。b：3組PM細胞植入小鼠股肌袋內第28天(上排)和6個月(下排)的X線檢查結果。D組：PM-B-sFlt1細胞組；E組：PM-B細胞組；F組：PM-B-VEGF 細胞組。

圖6 6組細胞植入體內后不同時間點的成骨、成軟骨定量變化圖

a、b：分別為C2C12-B-sFlt1(—◆—)、C2C12-B(—■—)、C2C12-B-VEGF(—▲—)組細胞植入小鼠股肌袋內后骨和軟骨組織的定量變化圖；c、d：分別為PM-B-sFlt1(—◆—)、PM-B(—■—)、PM-B-VEGF(—▲—)組細胞植入小鼠股肌袋內后骨和軟骨組織的定量變化圖。

3 討論

關于肌源性細胞為基礎的BMP4基因治療可誘導新骨形成已經有很多報道，但在此基礎上增加額外基因治療對其成骨過程的影響還不十分清楚[6-8]。VEGF 作為軟骨化骨過程中的一個重要生長因子，在軟骨組織轉變成骨組織的階段起到了非常重要的作用[9-10]。在這個階段，軟骨組織中的軟骨細胞隨著時間的推移開始變得肥大。肥大的軟骨細胞高度表達VEGF, 從而誘導新生血管的形成。而新生血管的形成又促進了新骨組織的形成和改建。為了保證實驗結果的科學性、合理性，該研究同時采用了2種肌源性的細胞群。這樣設計的目的是保證實驗結果的代表性和實用性。

C2C12 肌源性細胞群與PM肌源性細胞群雖然都具有體外分化成肌母細胞的能力，但兩者的區(qū)別也是非常明顯的。C2C12細胞是從骨骼肌損傷修復的小鼠模型中分離出，在體外經過多代的培養(yǎng)，最后形成的一組相對比較純的肌細胞群[11]。而PM細胞則是從小鼠骨骼肌內分離出的原代細胞群，其中主要包含成纖維細胞、成肌細胞兩大細胞群[12]。這些區(qū)別可能是造成2組細胞經多基因轉染而表現(xiàn)出不同的生物學行為的原因。

C2C12細胞經VEGF和BMP4的雙重轉染后喪失了體內成骨作用，而抑制VEGF作用的C2C12-B-sFlt1細胞在新骨形成的量上和C2C12-B組并沒有很大區(qū)別。說明在成骨過程中對VEGF的需要量是非常小的，而且對其抑制后的成骨量也沒有明顯的減少。PM細胞的實驗結果則和C2C12細胞略有不同，3組PM細胞的成骨過程在組織學、影像學和軟骨、骨組織的定量方面未見明顯的差異。該實驗結果也說明，C2C12和PM雖然都是小鼠的肌源性細胞群，但經多基因轉染后在體內表現(xiàn)出不同的生物學特性。所以，該結果也提示應用原代骨骼肌源性細胞作為BMP4基因治療的細胞載體是可行的。

在該研究中也發(fā)現(xiàn)了幾個非常有趣的現(xiàn)象。首先，如果仔細觀察第28天的C2C12-B-sFlt1、PM-B-sFlt1組以及與之相對應的C2C12-B和PM-B組，可以發(fā)現(xiàn)轉染sFlt1組的細胞在成骨的三維空間結構上與未轉染sFlt1組的細胞明顯不同。同樣的發(fā)現(xiàn)也出現(xiàn)在組織學檢查上。C2C12-B-sFlt1組在術后第28天仍可見軟骨組織形成和新骨的改建，而C2C12-B組在術后第14天時軟骨組織已經全部吸收了。所以，轉染sFlt1組的細胞所引發(fā)的持續(xù)骨形成和改建過程很可能導致了新骨形成的空間排布不同。對這一點的進一步理解可能為將來控制干細胞基因治療在體內成骨的形狀提供線索。其次，C2C12-B-VEGF 組在植入小鼠的股肌袋內非但沒有誘發(fā)成骨反應，反而是術后早期局部出現(xiàn)軟組織腫塊，后期該腫塊出現(xiàn)了類似血管瘤的組織學表現(xiàn)。該現(xiàn)象的機制目前還不十分清楚，分析可能是植入細胞表達過多的VEGF和BMP4，兩者的共同作用誘發(fā)體內的血管內皮細胞惡性增殖和分化而形成的血管瘤組織。

綜上所述，骨骼肌源性細胞作為BMP4基因治療的基礎細胞，用來在體內誘導新生骨組織形成是可行的，而在增加了VEGF 和sFlt1基因的多基因治療后，2組肌源性細胞的表現(xiàn)不盡相同。但是過多的VEGF會抑制新骨的形成，甚至產生不良的后果。

致謝：該課題在選題及研究過程中得到國家自然科學基金面上項目資助，實驗設計及開展得到鄭州大學第一附屬醫(yī)院重點實驗室和骨科各位專家教授的指導與幫助。

[3]李廣恒,金丹,鄭波,等.骨骼肌來源的細胞在骨和軟骨組織修復與再生中的應用[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2013,15(3):266

[6]Peng H,Usas A,Hannallah D,et al.Noggin improves bone healing elicited by muscle stem cells expressing inducible BMP4[J].Mol Ther,2005,12(2):239

[8]迭小紅,羅慶,陳聰,等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白9、6雙表達腺病毒載體的構建及其成骨誘導作用[J].南方醫(yī)科大學學報,2013,33(9):1273

[9]Liu Y,Olsen BR.Distinct VEGF functions during bone development and homeostasis[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2014,62(5):363

[10]Maes C.Role and regulation of vascularization processes in endochondral bones[J].Calcif Tissue Int,2013,92(4):307

[11]Yaffe D,Saxel O.Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle[J].Nature,1977,270(5639):725

[12]Li G,Zheng B,Meszaros LB,et al.Identification and characterization of chondrogenic progenitor cells in the fascia of postnatal skeletal muscle[J].J Mol Cell Biol,2011,3(6):369

(2015-01-24 收稿 責任編輯姜春霞)

Investigation of endochondral bone formation induced by mouse myogenic cells based on retrovirus containing BMP4,VEGF， and sFlt1 genes therapy

LIYi,LIUGuanlei,TANGHaojie,ZHANGBao,YUANHongtao,XUJianzhong,LIGuangheng

DepartmentofOrthopaedicSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

myogenic cell;gene therapy;bone morphogenetic protein 4;vascular endothelial growth factor;mouse

Aim: To investigate the effect of VEGF and sFlt1 on the ectopic bone formation induced by myogenic cells based on Retro-BMP4 gene therapy. Methods: C2C12 and PM cells were used in this study. The cells were transduced with Retro-BMP4, combination of Retro-BMP4 and Retro-VEGF, combination of Retro-BMP4 and Retro-sFlt1, respectively. When transduced cells were ready, they were implanted into the skeletal muscle pocket of SCID mice hind leg with gelfoam. Histological and imaging examination which included X-ray were used to evaluate the process of ectopic bone formation.Results: Both C2C12-B-sFlt1 and C2C12-B cells were able to induce the ectopic endochondral bone formation in the muscle pocket. There was no difference between the two groups regarding to the amount of bone tissues. The only difference between the two groups was the three dimensional orientation of new bone tissues under the examination of X-ray. C2C12-B-VEGF group did not induce any bone formation in the muscle pocket. Histological results showed that this group produced the neoplasm which was more like hemangioma tissue. Three groups including PM-B-sFlt1,PM-B,PM-B-VEGF induced similar process of ectopic endochondral bone formation. There was no difference among three cell groups regarding to the amount of bone tissues during the 35 days observation. Conclusion: Myogenic cells isolated from skeletal muscle could be used as the cell source for BMP4 gene therapy. When the VEGF and sFlt1 genes are added in the process, the process of ectopic endochondral bone formation displays individual cell-based characteristics.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.002

*國家自然科學基金面上項目 81472136

R34