商丹丹，田 杰，季 燕，史長河，吳 軍，楊 靖，秦 潔，宋 波，王莉梅，毛澄源，駱海洋，許予明，孫石磊#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 鄭州 450052

家族性阿爾茨海默病家系淀粉樣前體蛋白基因突變檢測

商丹丹1)，田 杰2)，季 燕1)，史長河1)，吳 軍1)，楊 靖1)，秦 潔1)，宋 波1)，王莉梅1)，毛澄源1)，駱海洋1)，許予明1)，孫石磊1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 鄭州 450052

#通信作者，女，1969年9月生，博士，教授，研究方向：神經(jīng)遺傳變性病，E-mail：sunshilei18@hotmail.com

阿爾茨海默病；淀粉樣前體蛋白基因；突變

目的：研究1個(gè)中國漢族早發(fā)型家族性阿爾茨海默病(EOFAD)家系的臨床癥狀及其致病基因的突變形式。方法：收集1個(gè)EOFAD家系，分析2例患者及其他家系成員的臨床表現(xiàn)及輔助檢查結(jié)果。采集患者及部分家系成員外周血，提取基因組DNA，應(yīng)用PCR聯(lián)合直接測序法依次行早老素1(PS-1)基因、早老素2(PS-2)基因及淀粉樣前體蛋白(APP)基因第16、17號(hào)外顯子基因檢測。結(jié)果：該家系2例患者發(fā)病年齡較早，均以記憶力下降為首發(fā)癥狀，病情呈進(jìn)行性加重，均出現(xiàn)癲癇大發(fā)作及肌張力增高等其他癡呆類型少見的臨床癥狀。在該家系2例患者中發(fā)現(xiàn)APP基因第17號(hào)外顯子2 149位堿基發(fā)生G→A突變，使APP第717號(hào)氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，發(fā)生V717I突變；未發(fā)現(xiàn)PS-1、PS-2基因突變。結(jié)論：在中國漢族EOFAD家系中發(fā)現(xiàn)了APP基因的V717I突變，進(jìn)一步證明了APP基因突變是EOFAD的重要致病原因。

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能、日常生活能力下降及精神行為異常等。以65歲為界，AD可分為早發(fā)型AD(early-onset AD,EOAD)及晚發(fā)型AD(late-onset AD,LOAD)。62%的EOAD患者有家族史，其中約13%符合常染色體顯性遺傳[1]。EOAD主要與早老素(presenilin,PS)-1、PS-2、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)、Tau蛋白等基因突變有關(guān)。Raux等[2]于2005年報(bào)道，在常染色體顯性EOAD中約66%由PS-1基因突變引起，16%由APP基因突變引起。作者收集了1個(gè)早發(fā)型家族性AD(early-onset familial AD,EOFAD)家系，觀察其臨床表現(xiàn)，并對(duì)其進(jìn)行PS-1基因、PS-2基因及APP基因第16、17號(hào)外顯子檢測，以期進(jìn)一步了解國內(nèi)EOAD家系基因突變情況及豐富AD基因突變數(shù)據(jù)庫。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013年就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的1個(gè)家族性認(rèn)知功能下降家系，應(yīng)用簡易精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination,MMSE)、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(montreal congnitive assessment,MoCA)及日常生活能力量表(activity of daily living scale,ADL)行癡呆篩查。采用美國神經(jīng)病學(xué)、語言機(jī)能障礙和卒中研究所及AD和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS-ADRDA)修訂后標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行AD的診斷。該研究獲鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集 對(duì)家系成員進(jìn)行詳細(xì)的神經(jīng)系統(tǒng)檢查及體格檢查，完善甲狀腺功能、葉酸、維生素B12、肝腎功能及頭部MRI檢查，并詳細(xì)詢問病史及家族史。

1.3 基因測序及產(chǎn)物分析 抽取患者及部分家系成員外周血2 mL，提取外周血基因組DNA，將DNA樣本稀釋至50 mg/L備用。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4]，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix(上海生工生物工程股份有限公司)12.5 μL，超純水9.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，以后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃直到48 ℃，共19個(gè)循環(huán)； 95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，之后進(jìn)行g(shù)oldview染色并在紫外線下觀察結(jié)果。將上述PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司直接測序。測序結(jié)果應(yīng)用DNASTAR(Vension 7.1)軟件分析，并與人類基因組基因比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料及輔助檢查結(jié)果 EOFAD家系圖見圖1。先證者(圖1 Ⅲ-3)，女，48歲，河南人?；颊? a前逐漸出現(xiàn)記憶力下降，以近期記憶下降為主，遠(yuǎn)期記憶尚可，頭部MRI示腦萎縮；3 a前上述癥狀明顯加重，伴精神行為異常、性格改變，表現(xiàn)為不認(rèn)路、不認(rèn)人、自言自語、喜歡罵人、易激惹、出現(xiàn)幻覺，漸出現(xiàn)小便失禁、不避人，上述癥狀進(jìn)行性加重；目前全面認(rèn)知功能下降，日常生活完全不能自理。期間于多家醫(yī)院就診，診斷不明，間斷服用“天智顆粒、銀杏葉片”等治療，效果差。后期隨訪發(fā)現(xiàn)其于49歲時(shí)出現(xiàn)癲癇大發(fā)作。查體：神志清、易激惹，記憶力、計(jì)算力、定向力、理解力、閱讀能力均下降。顱神經(jīng)查體無異常。四肢肌力正常，肌張力增高，四肢腱反射亢進(jìn)，雙側(cè)病理征陰性，共濟(jì)、深淺感覺查體不配合。家族史：其外祖父(圖1 Ⅰ-2)已逝，生前有“癡呆”病史，具體病情及死因不詳；其母(圖1 Ⅱ-2)，50歲左右出現(xiàn)認(rèn)知功能下降，生前有走失史，未予診治，死因不詳。其姐(圖1 Ⅲ-2)，50歲，7 a前出現(xiàn)記憶力下降，漸出現(xiàn)不認(rèn)人、不認(rèn)路、日常生活能力下降，1 a前出現(xiàn)全面認(rèn)知功能下降，大小便失禁，但尚可自行進(jìn)食，于50歲時(shí)出現(xiàn)癲癇大發(fā)作1次。查體結(jié)果同Ⅲ-3。家系中余成員無類似表現(xiàn)。輔助檢查：Ⅲ-2、Ⅲ-3甲狀腺、肝、腎功能和血脂、葉酸、維生素B12、血同型半胱氨酸水平均正常。部分家系成員主要臨床特征及輔助檢查結(jié)果見表1。Ⅲ-2、Ⅲ-3診斷為AD，均于45歲之前發(fā)病，且家系中Ⅰ-2、Ⅱ-2有類似病史，Ⅱ-2于50余歲發(fā)病，該家系符合EOFAD。

圖1 EOFAD家系圖

指標(biāo)Ⅲ-1Ⅲ-2Ⅲ-3性別男女女發(fā)病年齡/歲-4344起病形式-緩慢緩慢病程-約7a約4a首發(fā)癥狀無記憶力下降記憶力下降精神障礙無有有癲癇無有有頭部MRI正常腦萎縮腦萎縮MMSE評(píng)分3032MoCA評(píng)分2900

-：未發(fā)病。

2.2 DNA測序結(jié)果 采集該家系中Ⅱ-1、Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-6外周血并行基因檢測(未采集到Ⅲ-4、Ⅲ-5外周血)，在家系Ⅲ-2、Ⅲ-3中發(fā)現(xiàn)APP基因第717號(hào)密碼子發(fā)生GTC→ATC錯(cuò)意突變(第17號(hào)外顯子第2 149位堿基發(fā)生G→A突變)，使氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?V717I)，而在Ⅱ-1、Ⅲ-1、Ⅲ-6中均未發(fā)現(xiàn)APP、PS-1、PS-2基因突變(圖2)。

圖2 APP基因第17號(hào)外顯子測序結(jié)果

a：正常測序圖，其第2 149位堿基為G(箭頭所示)；b、c：Ⅲ-2、Ⅲ-3的第2 149位堿基發(fā)生G→A突變(箭頭所示)。

3 討論

我國對(duì)EOAD的遺傳學(xué)研究已取得一定的進(jìn)展，目前已有PS-1、APP基因突變被報(bào)道，如PS-1 V97L、A136G、S169del、APP V715M等[5-7]。由APP基因突變引起的家族性AD在中國EOFAD患者中并不常見[8-9]。

β淀粉樣蛋白(Aβ)在腦內(nèi)異常聚集是AD的標(biāo)志性病理改變，是由跨膜蛋白APP裂解而成，其通過影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡等多種途徑發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。APP有兩種裂解途徑：正常情況下APP在α-分泌酶的作用下產(chǎn)生非致病性片段，只有當(dāng)編碼APP的基因發(fā)生突變或其他原因?qū)е娄?分泌酶活性異常增高時(shí)產(chǎn)生Aβ42和Aβ40，而Aβ42的絕對(duì)或者相對(duì)增高是AD的重要病理過程[10]。APP基因位于21號(hào)染色體上。既往研究[11-12]對(duì)APP全部編碼區(qū)行直接測序分析，但檢測結(jié)果表明基因突變均發(fā)生在APP的第16、17號(hào)外顯子上，因此該研究中作者只對(duì)APP基因第16、17號(hào)外顯子行基因突變分析。該研究發(fā)現(xiàn)的APP基因V717I 突變也稱為London APP，是世界上報(bào)道的第一種引起EOFAD的致病基因突變形式[13]。

回顧分析既往研究可以發(fā)現(xiàn)，不同APP基因突變類型的臨床特征不盡相同，存在異質(zhì)性。APP第692～694位氨基酸改變主要與腦出血有關(guān)[14]，而既往報(bào)道[15-16]的London APP突變類型的主要臨床特征為首發(fā)記憶力下降，其后出現(xiàn)失用、失語、精神行為異常，最后出現(xiàn)非齒輪樣肌張力增高、額葉釋放征，部分患者出現(xiàn)幻覺、癲癇、肌陣攣，直至坐椅不起。作者收集的這一EOFAD家系中，Ⅲ-3于44歲發(fā)病，首發(fā)癥狀為記憶力下降，其后逐漸出現(xiàn)失用、失語、日常生活能力喪失，病情進(jìn)展較快，4 a內(nèi)發(fā)展至大小便失禁、日常生活完全不能自理且于起病5 a后出現(xiàn)癲癇大發(fā)作；Ⅲ-2于43歲起病，病程變化同Ⅲ-3，但病情進(jìn)展較Ⅲ-3慢，發(fā)病6 a后出現(xiàn)大小便失禁、日常生活完全不能自理，50歲出現(xiàn)癲癇大發(fā)作。該研究中AD患者起病及病情發(fā)展與既往報(bào)道的大多數(shù)APP V717I突變類型的AD患者相似，后期均出現(xiàn)癲癇大發(fā)作、肌張力增高癥狀，提示在EOFAD患者中應(yīng)警惕此癥狀。

綜上所述，作者在一中國EOFAD家系中發(fā)現(xiàn)APP基因第17號(hào)外顯子2 149位堿基發(fā)生G→A突變，引起V717I突變。盡管APP基因突變在中國人群中并不普遍，但該研究結(jié)果豐富了AD基因突變數(shù)據(jù)庫，提示在進(jìn)行EOFAD基因篩查及產(chǎn)前診斷時(shí)勿遺漏APP基因檢測。

[1]Campion D,Dumanchin C,Hannequin D,et al.Early-onset autosomal dominant Alzheimer disease: prevalence,genetic heterogeneity,and mutation spectrum[J].Am J Hum Genet,1999,65(3):664

[2]Raux G,Guyant-Maréchal L,Martin C,et al.Molecular diagnosis of autosomal dominant early onset Alzheimer′s disease: an update[J].J Med Genet,2005,42(10):793

[3]Dubois B,Feldman HH,Jacova C,et al.Research criteria for the diagnosis of Alzheimer′s disease:revising the NINCDS-ADRDA criteria[J].Lancet Neurol,2007,6(8):734

[4]魏姣花.家族性阿爾茨海默病致病基因突變分析[D].長沙:中南大學(xué),2011.

[5]Fang BY,Jia JP.The effect of two newly Chinese presenilin-1 mutations on the sensitivity to trophic factor withdrawal in human neuroblastoma cells[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2007,87(5):336

[6]Guo J,Wei J,Liao S,et al.A novel presenilin 1 mutation (Ser169del) in a Chinese family with early-onset Alzheimer′s disease[J].Neurosci Lett,2010,468(1):34

[7]南善姬,韓艷秋,范佳,等.中國早發(fā)性家族性阿爾茨海默病一家系淀粉樣前體蛋白基因突變[J].中華神經(jīng)科雜志,2011,44(1):47

[8]賈建平,許二赫.家族性Alzheimer病淀粉樣蛋白前體基因第16、17外顯子的突變分析[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2003,11(4):201

[9]田文強(qiáng),王擁軍,康德萱,等.阿爾茨海默病淀粉樣蛋白前體基因突變的初步研究[J].中國心理衛(wèi)生雜志,1999,13(5):260

[10]向詩琪,陳萍.β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性作用及治療研究進(jìn)展[J].世界科技研究與發(fā)展,2012,34(6):993

[11]Fujigasaki H,Naruse S,Kaneko K,et al.Mutational analysis of the amyloid precursor protein gene in Japanese familial Alzheimer′s disease kindreds[J].Hum Genet,1994,93(4):460

[12]Liddell MB,Bayer AJ,Owen MJ.No evidence that common allelic variation in the Amyloid Precursor Protein(APP) gene confers susceptibility to Alzheimer′s disease[J].Hum Mol Genet,1995,4(5):853

[13]Goate A,Chartier-Harlin MC,Mullan M,et al.Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer′s disease[J].Nature,1991,349(6311):704

[14]Brooks WS,Martins RN,De Voecht J,et al.A mutation in codon 717 of the amyloid precursor protein gene in an Australian family with Alzheimer′s disease[J].Neurosci Lett,1995,199(3):183

[15]Matsumura Y,Kitamura E,Miyoshi K,et al.Japanese siblings with missense mutation(717Val --> Ile) in amyloid precursor protein of early-onset Alzheimer′s disease[J].Neurology,1996,46(6):1721

[16]Tedde A,Nacmias B,Ciantelli M,et al.Identification of new presenilin gene mutations in early-onset familial Alzheimer disease[J].Arch Neurol,2003,60(11):1541

(2014-11-13 收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Mutational analysis of amyloid precursor protein gene in a family with Alzheimer disease

SHANGDandan1),TIANJie2),JIYan1),SHIChanghe1)，WUJun1),YANGJing1),QINJie1),SONGBo1),WANGLimei1),MAOChengyuan1),LUOHaiyang1),XUYuming1),SUNShilei1)

1)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)SchoolofNursing,ZhengzhouRailwayVocationalandTechnicalCollege,Zhengzhou450052

Alzheimer disease; amyloid precursor protein gene; mutation

Aim: To analyze the clinical symptoms and mutation of pathogenic genes in a Chinese family with early-onset familial Alzheimer disease(EOFAD).Methods: The clinical features and the results of auxiliary examination were analyzed. By PCR and direct DNA sequencing, mutational analysis of presenilin-1(PS-1),presenilin-2(PS-2), and amyloid precursor protein(APP) gene was performed.Results: The two patients with early onset age developed an insidious onset of difficulties in memory. They both showed epilepsy, hypermyotonia and some other symptoms which were rarely found in the course of the disease. Molecular genetic analysis revealed that the 2 patients had a mutation of c.2 149 G→A in exon 17 of APP gene, which resulted in the amino acid substitution as V717I.Conclusion: There is a V717I mutation of the APP gene in a family with EOFAD,which demonstrates that APP gene mutation is the important pathogenesis of EOFAD.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.029

R749.16