張 仁，張圣潔，張學(xué)研，李 彤，臧文巧

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室 鄭州 450001

CLPTM1L與miR-494靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

張 仁，張圣潔，張學(xué)研，李 彤，臧文巧#

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室 鄭州 450001

#通信作者，女，1979年8月生，博士，副教授，研究方向：食管癌病因?qū)W，E-mail: zangwenqiao@sina.com

miR-494; CLPTM1L; 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

目的：確定miR-494與CLPTM1L的靶向關(guān)系。方法：采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-494與CLPTM1L基因的結(jié)合位點(diǎn)。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增CLPTM1L基因3’UTR片段，并克隆至pmirGLO載體，構(gòu)建野生型及突變型重組雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將培養(yǎng)的293T細(xì)胞分為4組，分別共轉(zhuǎn)染miR-494或陰性對(duì)照和pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR或pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR，檢測(cè)4組細(xì)胞中熒光素酶活性。結(jié)果：酶切和測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了野生型及突變型重組雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR；與共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和突變型CLPTM1L 3’UTR質(zhì)粒的293T細(xì)胞中熒光素酶活性(1.056 4±0.163 4)、共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列和突變質(zhì)粒的293T細(xì)胞中熒光素酶活性(0.961 3±0.177 9)或野生型質(zhì)粒的293T細(xì)胞中熒光素酶活性(0.983 4±0.001 2)相比，共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3’UTR質(zhì)粒的293T細(xì)胞中熒光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明顯降低(F=4.476，P=0.040)，其他3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：CLPTM1L與miR-494存在靶向關(guān)系。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組內(nèi)源性的、高度保守的非編碼RNA，通過與mRNA 3’非編碼區(qū)(3’UTR)結(jié)合,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[1-2]，進(jìn)而參與一系列生物學(xué)過程,如脂肪代謝、細(xì)胞分化、凋亡等[3-4]。作者通過生物信息學(xué)方法分析了唇腭裂跨膜1樣蛋白(cleft lip and palate transmembrane 1 like，CLPTM1L)基因與miR-494的靶向關(guān)系，并進(jìn)一步應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證miR-494對(duì)CLPTM1L的靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞株購(gòu)自ATCC公司，T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ、Taq DNA 聚合酶、dNTP 購(gòu)自TaKaRa 公司，DH5α感受態(tài)大腸桿菌購(gòu)自Solarbio公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、總RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，質(zhì)粒pmirGLO、熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)、DNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；根據(jù)CLPTM1L基因3’UTR序列(NM_030782)設(shè)計(jì)合成引物，上下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)，PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1，由Invitrogen公司完成測(cè)序； miR-494 mimics 及陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪公司。

表1 PCR引物序列

1.2 miR-494靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 采用TargetScan 6.0、miRBase和miRanda軟件在線搜索可能與CLPTM1L基因3’UTR作用的miRNA。

1.3 CLPTM1L基因野生型和突變型的3’UTR片段的擴(kuò)增及純化 以健康人外周血DNA 為模板，以野生型CLPTM1L 3’UTR的上、下游引物進(jìn)行野生型3’UTR片段擴(kuò)增，以野生型CLPTM1L 3’UTR上游引物和突變型CLPTM1L 3’UTR下游引物進(jìn)行突變型3’UTR片段擴(kuò)增?？傮w系均為30 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸3 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物，用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，切膠純化回收。

1.4 野生型及突變型CLPTM1L基因T載體的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增的CLPTM1L基因野生型及突變型膠回收產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，在T4連接酶的作用下，置于4 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)細(xì)菌，進(jìn)行重組子的篩選與鑒定。

1.5 CLPTM1L基因野生型及突變型雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書分別提取野生型和突變型重組pGEM-T質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)再次純化回收，用T4 DNA 連接酶與熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒，XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切初步鑒定，測(cè)序。重組質(zhì)粒分別命名為pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底約75%時(shí)可傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。采用胰蛋白酶消化293T細(xì)胞，PBS洗滌后，再加1.4 mL PBS調(diào)整細(xì)胞密度至2×107mL-1，分4組(A組：共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列和野生型CLPTM1L 3’UTR；B組：共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3’UTR；C組：共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列和突變型CLPTM1L 3’UTR；D組：共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和突變型CLPTM1L 3’UTR)進(jìn)行電轉(zhuǎn)，每組250 μL細(xì)胞懸液中分別加入30 μL miRNA-494 mimics或陰性對(duì)照序列和相應(yīng)的重組質(zhì)粒(pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR/pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR)6 μL，混勻后分別置于4個(gè)BTX電轉(zhuǎn)杯中(4 mm)，ECM2001電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)，之后逐滴加入有血清的培養(yǎng)液中混勻，接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 各組細(xì)胞中熒光素酶活性的變化 收集轉(zhuǎn)染30 h后的293T細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明，使用熒光發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定細(xì)胞中螢火蟲熒光素信號(hào)及海腎熒光素信號(hào)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較4組細(xì)胞中熒光素酶活性的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果 見圖1。通過在線分析軟件分析，CLPTM1L基因3’UTR 465-471序列與miR-494序列間存在特定結(jié)合區(qū)域，CLPTM1L是miR-494的靶基因。

圖1 miR-494在CLPTM1L 3’UTR 上的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)

2.2 野生型及突變型CLPTM1L基因T載體的構(gòu)建結(jié)果 見圖2。PCR結(jié)果顯示，擴(kuò)增野生型CLPTM1L的3’UTR 序列(446 bp)及突變型CLPTM1L 3’UTR 序列(452 bp)，與理論片段大小一致( 圖2左)。重組T載體通過XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切初步鑒定，分別得到野生型3’UTR片段及其突變型3’UTR片段( 圖2右)，與預(yù)期相符。

圖2 野生型及突變型CLPTM1L基因T載體的構(gòu)建結(jié)果

左：PCR 擴(kuò)增CLPTM1L基因3’UTR 序列(M: DNA Marker; 1: 野生型；2：突變型)；右：T載體重組質(zhì)粒XbaⅠ、XhoⅠ雙酶切(M：DNA Marker；1:野生型重組質(zhì)粒雙酶切片段；2：突變型重組質(zhì)粒雙酶切片段)。

2.3 重組野生型及突變型CLPTM1L基因pmirGLO載體的構(gòu)建結(jié)果 見圖3。將重組pmirGLO載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑取野生型/突變型菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示與理論擴(kuò)增的PCR片段大小一致(圖3左)。測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入的片段與預(yù)期完全一致(圖3右)。

圖3 重組野生型及突變型CLPTM1L基因pmirGLO載體的構(gòu)建及部分測(cè)序結(jié)果

A：PCR 擴(kuò)增CLPTM1L基因3’UTR 序列(M：DNA Marker；1：野生型CLPTM1L 3’UTR；2：突變型CLPTM1L 3’UTR)；右：pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR部分測(cè)序圖。

2.4 各組細(xì)胞中熒光素酶活性的變化 D組(1.056 4±0.163 4)、C組(0.961 3±0.177 9)或野生型質(zhì)粒(0.983 4±0.001 2)的293T細(xì)胞中熒光素酶活性相比，共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3’UTR的293T細(xì)胞中熒光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明顯降低(F=4.476P=0.040)，其他3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

在miRNA的研究中，經(jīng)常用熒光素酶報(bào)告技術(shù)來驗(yàn)證目的基因是否為miRNA的靶基因。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的原理是以熒光素為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)[5]。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。在以往實(shí)驗(yàn)[6]中通常使用pGL3報(bào)告載體，還需加入對(duì)照載體pRL-TK，實(shí)驗(yàn)時(shí)需要同時(shí)轉(zhuǎn)染2個(gè)載體，步驟較為復(fù)雜，無形中增加了成本和勞動(dòng)量，而且結(jié)果不穩(wěn)定，批次內(nèi)和批次間差異較大。該實(shí)驗(yàn)使用的pmirGLO報(bào)告載體[7]同時(shí)含有螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因，可以在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試，快速、靈敏、簡(jiǎn)便，還可減少內(nèi)在因素的變化對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，如不同實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解效率的不同等[8]。

近年來研究[9]發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，其通過多種靶基因、信號(hào)通路對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)控。目前已證實(shí)miR-494的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[10]，如胃癌[11]、胃腸道間質(zhì)瘤、膽管癌、淋巴瘤[12-13]、肺癌[14-15]等。作者利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)CLPTM1L可能是miR-494的靶基因，通過構(gòu)建野生型和突變型CLPTM1L基因雙熒光素酶報(bào)告載體，經(jīng)過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-494與CLPTM1L基因具有靶向關(guān)系，且熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-494可以特異性作用于CLPTM1L基因的3’UTR位置的465-471序列，對(duì)其上游Luc基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究miR-494在腫瘤中的作用提供了部分參考。

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(2014-09-02 收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Identification of miR-494 target gene-CLPTM1L by luciferase reporter assay

ZHANGRen,ZHANGShengjie,ZHANGXueyan,LITong,ZANGWenqiao

DepartmentofImmunologyandMicrobiology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

miR-494;CLPTM1L;luciferase reporter assay

Aim: Analysis and identification of miR-494 potential target gene CLPTM1L. Methods: Bioinformatics analysis suggested CLPTM1L was a target of miR-494. PCR was performed to obtain wild-type and mutant CLPTM1L 3’UTR fragments, which were cloned into pmirGLO and constructed the recombinant plasmids pmirGLO-CLPTM1L-W and pmirGLO-CLPTM1L-M, respectively. 293T cells were cultured. Two recombinant plasmids were co-transfected into 293T cells with the miR-494 mimics or scrambled oligonucleotide(negative control), and the relative luciferase activity was determined by luciferase reporter assay. Results: With identification of restriction enzyme digestion and sequencing, the sequences of CLPTM1L-W 3’UTR and CLPTM1L-M 3’UTR were cloned into pmirGLO successfully．Compared with the group of miR-494 mimics co-transfected with pmirGLO-CLPTM1L-M(1.056 4±0.163 4) and the groups of miR-NC co-transfected with pmirGLO-CLPTM1L-W(0.983 4±0.001 2) or pmirGLO-CLPTM1L-M(0.961 3±0.177 9), the relative luciferase activity in group of miR-494 mimics co-transfected with pmirGLO-CLPTM1L-W showed a significant decrease(0.651 6±0.136 4；F=4.476，P=0.040). No difference was found among the aforementioned three groups(P>0.05).Conclusion: CLPTM1L is a target gene of miR-494.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.033

Q786