李光偉， 苗宏志， 李 波， 王國(guó)忠， 金 莉， 林 巖， 鄧志會(huì)， 肖 微

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸心外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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鈣敏感受體通過(guò)G蛋白-PLC-IP3信號(hào)途徑調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈張力*

李光偉1△， 苗宏志2， 李 波1， 王國(guó)忠1， 金 莉1， 林 巖1， 鄧志會(huì)1， 肖 微1

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸心外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

目的： 探討鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)在肺血管張力調(diào)節(jié)中的作用及信號(hào)途徑。方法: 采用Ⅱ型膠原酶消化法提取大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)，激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)觀察不同條件下PASMCs中鈣離子濃度的變化，組織浴槽血管環(huán)技術(shù)觀察血管張力的變化。結(jié)果: CaSR激動(dòng)劑(鈣、釓)引起劑量依賴性的細(xì)胞內(nèi)鈣增加和血管張力增大， U73122和D609(PLC抑制劑)以及2-APB和肝素(IP3受體抑制劑)可減弱CaSR的作用(P<0.05)，而U73343(U73122的無(wú)生物活性類似物)則無(wú)此作用(P>0.05)。結(jié)論: CaSR活化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣增加，進(jìn)而引起肺動(dòng)脈環(huán)收縮，這些過(guò)程是通過(guò)G蛋白-PLC-IP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

鈣敏感受體； 肺動(dòng)脈張力； 細(xì)胞內(nèi)鈣

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體，其活化后通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加進(jìn)而參與多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[1]。我們前期研究證實(shí)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)中有鈣敏感受體的表達(dá)，缺氧能夠活化肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的CaSR，并促進(jìn)其的增殖，進(jìn)而參與缺氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生[2-4]。肺動(dòng)脈收縮和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的兩大病理生理學(xué)基礎(chǔ)。CaSR在肺動(dòng)脈張力的調(diào)節(jié)中是否其作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本文就上述問(wèn)題展開(kāi)研究。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

U73122、U73343、2-APB、GdCl3、NiCl2、CdCl2、Fluo-3/AM及Ⅱ型膠原酶均購(gòu)自Sigma。

解剖顯微鏡 (Nikon)；激光共聚焦顯微鏡(Leica)；ALC-M離體組織器官實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 肺動(dòng)脈分離和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 肺動(dòng)脈分離和平滑肌細(xì)胞提取、培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。在解剖顯微鏡下分離大鼠肺動(dòng)脈，采用Ⅱ型膠原酶消化法提取原代平滑肌細(xì)胞，第3～5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定 細(xì)胞棄培養(yǎng)液，含鈣Krebs洗滌。Fluo-3/AM(5 μmol/L)37 ℃避光孵育40 min；去除負(fù)載液，含鈣Krebs洗滌，備用。用激光掃描共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[Ca2+]i的變化，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm[6]。

2.3 肺動(dòng)脈環(huán)張力的測(cè)定 Wister大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(2 mg/kg)。開(kāi)胸取心臟和肺臟，置于4 ℃盛有HEPES液的培養(yǎng)皿中，顯微解剖鏡下，游離直徑0.3～0.7 mm肺內(nèi)肺動(dòng)脈，除去血管周圍脂肪和結(jié)締組織，剪成長(zhǎng)度約為3 mm血管環(huán)，懸掛在2根鎢絲三角環(huán)上，一端掛在塑料支架下面的鐵鉤上，置于盛有4 mL Krebs液恒溫浴槽內(nèi)，另一端掛在張力換能器的電極上，持續(xù)通以95% O2-5% CO2混合氣。在30 min內(nèi)逐漸給肺動(dòng)脈環(huán)負(fù)荷0.3 g的基礎(chǔ)張力，平衡1 h后，分別測(cè)定不同條件下的血管張力[7]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。采用配對(duì)t檢驗(yàn)方法判斷其差異顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 [Ca2+]O增加引起[Ca2+]i增加

如圖1所示，當(dāng)[Ca2+]O從5 mmol/L增加到12.5 mmol/L時(shí)，PASMCs內(nèi)熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性增加，當(dāng)[Ca2+]O達(dá)到10 mmol/L時(shí)，進(jìn)入平臺(tái)期與基礎(chǔ)濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 [Ca2+]O增加引起[Ca2+]i增加是通過(guò)CaSR活化所介導(dǎo)的

如圖2所示，10 mmol/L CaCl2引起[Ca2+]i增加(P<0.05)，在0.1 mmol/L NiCl2(鈉-鈣交換阻斷劑)和0.02 mmol/L CdCl2(L型鈣通道阻斷劑)預(yù)孵育組[Ca2+]iFI/FI0有所降低，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，10 μmol/L NPS2390(CaSR阻斷劑)預(yù)孵育組出現(xiàn)類似的變化。而NiCl2、CdCl2及NPS2390共同預(yù)孵育情況下，[Ca2+]iFI/FI0明顯降低，與control組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 U73122、U73343、2-APB、D609及肝素(heparin)對(duì)CaSR 活化所致PASMCs [Ca2+]i變化的影響

10 μmol/L U73122(PLC抑制劑)及100 μmol/L D609(PLC抑制劑)預(yù)處理后，CaCl2引起[Ca2+]i增加的作用被明顯減弱(P<0.05)，而10 μmol/L U73343(無(wú)生物效應(yīng)的U73122的類似物)預(yù)處理則沒(méi)有引起上述變化；另外75 μmol/L 2-APB(IP3抑制劑)及50 μmol/L肝素(IP3受體抑制劑)亦可明顯減弱CaCl2引起[Ca2+]i增加的作用(P<0.05)。300 μmol/L GdCl3能夠引起類似的反應(yīng)，見(jiàn)圖3、4。

4 [Ca2+]O增加引起肺動(dòng)脈環(huán)張力的變化

以0.3 g的基礎(chǔ)張力作為100%(control)。如圖5所示，細(xì)胞外Ca2+濃度在0.5～2.5 mmol/L時(shí)，肺動(dòng)脈環(huán)不發(fā)生收縮，當(dāng)細(xì)胞外Ca2+濃度升高到5～12.5 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)了劑量依賴性的血管收縮(P<0.05)。在0.1 mmol/L NiCl2(鈉-鈣交換阻斷劑)和0.02 mmol/L CdCl2(L-型鈣通道阻斷劑)預(yù)孵育組肺動(dòng)脈收縮有所降低，10 μmol/L NPS2390(CaSR阻斷劑)預(yù)孵育組出現(xiàn)類似的變化。而NiCl2、CdCl2及NPS2390共同預(yù)孵育情況下，肺動(dòng)脈環(huán)收縮顯著降低。

5 U73122、U73343、2-APB、D609及肝素對(duì)CaSR 活化引起肺動(dòng)脈環(huán)收縮的影響

U73122及D609預(yù)處理后，肺動(dòng)脈環(huán)收縮作用明顯減弱(P<0.05)，U73343預(yù)處理則沒(méi)有引起上述變化；2-APB及肝素同樣引起肺動(dòng)脈環(huán)收縮減弱(P<0.05)。GdCl3能夠引起類似的反應(yīng),見(jiàn)圖6、7。

討 論

肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的兩大病理生理學(xué)基礎(chǔ)是肺血管收縮和肺血管重構(gòu)，我們前期研究證實(shí)CaSR可以促進(jìn)缺氧性肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生進(jìn)而可以促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。然而，CaSR在肺血管收縮中是否起作用，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

Figure 1.The effect of different extracellular calcium concentrations ([Ca2+]o) on the intracellular calcium concentrations ([Ca2+]i ) in the PASMCs.

CaSR是1993年新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體[1]。其激動(dòng)劑為多價(jià)陽(yáng)離子，如Ca2+、Gd3+及帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，Ca2+活化CaSR的EC50是3～4 mmol/L[9]。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到，[Ca2+]o在1.8～2.5 mmol/L并沒(méi)用引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，當(dāng)[Ca2+]o升高到5～12.5 mmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度以劑量依賴的形式增加。這就意味著在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaSR活化能夠引起[Ca2+]i增加。另外，在NiCl2和CdCl2預(yù)處理的情況下，[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度降低，但仍高于對(duì)照組，NPS2390預(yù)處理也可以使[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度降低，而在NiCl2、CdCl2以及NPS2390共同存在時(shí)，[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度明顯降低，與對(duì)照組無(wú)顯著差異。這些結(jié)果提示：CaSR和L型鈣通道及鈉鈣交換蛋白一起，共同參與了[Ca2+]o增加導(dǎo)致[Ca2+]i增加這一過(guò)程。

Figure 2.The effects of different inhibitors on the change of [Ca2+]i in the PASMCs induced by activated CaSR. Mean±SD. n=20. *P<0.05 vs control.

Figure 3.The effects of U73122, U73343, D609, 2-APB and heparin on the change of [Ca2+]i induced by CaCl2 in the PASMCs. Mean±SD. n=20. *P<0.05 vs control.

Figure 4.The effects of U73122,U73343,D609,2-APB and heparin on the change of [Ca2+]i induced by GdCl3 in PASMCs. Mean±SD. n=20. *P<0.05 vs control.

Figure 5.The effects of different inhibitors on constriction of pulmonary artery ring induced by increased [Ca2+]o . Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control; ## P<0.01 vs CaCl2 .

Figure 6.The effects of U73122, U73343, D609, 2-APB and heparin on constriction of pulmonic ring induced by CaCl2. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control.

Figure 7.The effects of U73122, U73343, D609, 2-APB and heparin on vasoconstriction of pulmonary artery ring induced by GdCl3. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control.

Wang等[10]證實(shí)細(xì)胞外鈣增加、Gd3+及精胺能夠引起大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)通過(guò)G蛋白-PLC-IP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路釋放Ca2+。我們發(fā)現(xiàn)，U73122和D609(PLC抑制劑)以及2-APB和肝素(IP3抑制劑)可以顯著減弱Ca2+及Gd3+誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加的作用，而U73122的無(wú)生物效應(yīng)類似物U73343則對(duì)這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加則無(wú)顯著作用。此結(jié)果充分說(shuō)明在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaSR活化誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加是通過(guò)G蛋白-PLC-IP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

我們知道，細(xì)胞內(nèi)鈣作為興奮-收縮偶聯(lián)因子參與心肌收縮和血管張力的調(diào)節(jié)。Wonneberger等[11]發(fā)現(xiàn)，在沙土鼠的蝸旋動(dòng)脈，細(xì)胞外鈣離子從1 mmol/L增加到10 mmol/L能夠引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加，并且可以相平行地引起血管收縮。在血管環(huán)實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到細(xì)胞外鈣離子濃度在5～12.5 mmol/L 時(shí)，肺動(dòng)脈環(huán)出現(xiàn)了劑量依賴性的收縮，Gd3+可以引起類似的變化。另外，這種血管收縮可以被NiCl2、CdCl2及NPS2390的預(yù)處理所減弱，提示Gd3+和Ca2+誘導(dǎo)的血管收縮至少部分是通過(guò)CaSR引起的。

文獻(xiàn)報(bào)道，CaSR的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與胞漿鈣庫(kù)相關(guān)聯(lián)[12]。因此我們?cè)跍y(cè)定血管張力時(shí)發(fā)現(xiàn)，Gd3+和Ca2+誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮作用能夠被U73122、D609、2-APB及肝素所抵消，而U73343則無(wú)上述作用，進(jìn)一步說(shuō)明CaSR活化所誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮是通過(guò)G-PLC-IP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：CaSR活化引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈環(huán)收縮，這一過(guò)程是通過(guò)G蛋白-PLC-IP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。由于肺動(dòng)脈收縮是缺氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的潛在機(jī)制之一，因此CaSR可能成為防治肺動(dòng)脈高壓的新靶點(diǎn)。

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Calcium-sensing receptor modulates pulmonary artery tension through G-protein-PLC-IP3pathways

LI Guang-wei1, MIAO Hong-zhi1, LI Bo1, WANG Guo-zhong1, JIN Li1, LIN Yan1, DENG Zhi-hui1, XIAO Wei1

(1DepartmentofPathophysiology,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China;2DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheFirstHospitalofQiqiharCity,Qiqihar161005,China.E-mail:qiqihaerlgw@163.com)

AIM: To observe the role of calcium-sensing receptor (CaSR) in the regulation of pulmonary artery tension. METHODS: The intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) was detected by laser-scanning confocal microscopy, and the pulmonary artery tension was determined by the pulmonary arterial ring technique. RESULTS: Increased levels of [Ca2+]oor Gd3+(an agonist of CaSR) induced the increase in [Ca2+]iand pulmonary artery constriction in a concentration-dependent manner. Additionally, the effects of Ca2+and Gd3+were inhibited by U73122 and D609 (specific inhibitor of PLC), and 2-APB and heparin (specific antagonist of IP3receptor). However, U73343 (U73122 inactive analogue) did not take effect. CONCLUSION: CaSR may be involved in the regulation of pulmonary artery tension by increasing [Ca2+]ithrough G-protein-PLC-IP3pathway.

Calcium-sensing receptor; Pulmonary artery tension; Intracellular calcium

1000- 4718(2015)01- 0018- 05

2014- 07- 23

2014- 10- 30

黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目(No. 12511618)

△通訊作者 Tel： 0452-2663161; E-mail: qiqihaerlgw@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.004