卜晨峰， 庾淦深， 徐 銀， 蘇志堅(jiān)， 黃亞東， 蘇澤軒△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院泌尿外科， 2醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東 廣州 510632)

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1,2-二甲磺酸乙烷預(yù)處理對(duì)雄性SD大鼠腎臟缺血再灌注損傷的影響*

卜晨峰1， 庾淦深1， 徐 銀1， 蘇志堅(jiān)2， 黃亞東2， 蘇澤軒1△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院泌尿外科，2醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東 廣州 510632)

目的： 探究1,2-二甲磺酸乙烷(EDS)預(yù)處理是否對(duì)雄性SD大鼠缺血再灌注腎臟損傷有保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法: 夾閉雙側(cè)腎蒂45 min，構(gòu)建雄性SD大鼠腎臟缺血再灌注模型；48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組(blank)、假手術(shù)組(sham)、腎臟缺血再灌注組(I/R)、EDS預(yù)處理+腎缺血再灌注組(EDS+I/R)、EDS預(yù)處理+睪酮+腎缺血再灌注組(EDS+TST+I/R)和閹割+腎缺血再灌注組(Cast+I/R)。術(shù)前1 h及再灌注后24 h采血檢測(cè)血清黃體生成素、睪酮、血肌酐、血尿素氮以及尿液腎損傷分子1(KIM-1)水平；取腎臟組織，檢測(cè)TNF-α水平、Fas mRNA與caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果: (1) EDS+I/R與Cast+I/R組比較，血肌酐和尿素氮無顯著差異(P>0.05)，但KIM-1水平卻低于Cast+I/R組(P<0.05)，2組血肌酐、血尿素氮和KIM-1均高于另外3組(P<0.05)。(2) 與術(shù)前1 h相比，再灌注術(shù)后24 h，EDS+I/R、Cast+I/R及EDS+TST+I/R組均伴睪酮及黃體生成素下降(P<0.05)。(3) EDS+I/R組TNF-α水平、Fas mRNA及caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著低于Cast+I/R與I/R組(P<0.05)。結(jié)論: EDS預(yù)處理可大幅降低血清睪酮水平，從而減輕雄性SD大鼠腎臟缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與TNF-α介導(dǎo)的Fas/FasL通路有關(guān)。

1,2-二甲磺酸乙烷； 腎臟； 腎損傷分子1； 睪酮

腎缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)過程在腎移植等需要短時(shí)間內(nèi)阻斷腎血流的手術(shù)中廣泛存在[1]。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，在急性腎衰竭患者中，男性的平均血肌酐(serum creatinine，SCr)日增長量、平均住院時(shí)間、隨訪等數(shù)據(jù)均明顯劣于女性患者[2]。而手術(shù)閹割(castration，Cast)后的雄性大鼠，經(jīng)過腎I/R處理后，腎損傷的程度接近雌性，且顯著小于未閹割雄性組[3]。這提示睪酮(testosterone，TST)可能是影響男性腎臟損傷程度的激素之一。1,2-二甲磺酸乙烷(ethane 1,2-dimethanesulfonate, EDS)可以特異性引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生一過性凋亡，進(jìn)而引起睪酮水平大幅下降[4]。但EDS預(yù)處理對(duì)雄性腎臟缺血再灌注的影響，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究通過EDS預(yù)處理雄性SD大鼠，并建立腎臟缺血再灌注模型，以探討EDS預(yù)處理對(duì)腎臟損傷程度的影響及其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠，9～10周齡，300～350 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。

EDS由暨南大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)；丙酸睪酮注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司；血清黃體生成素(luteinizing hormone, LH)和TST放射免疫檢測(cè)試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；腎損傷分子1(kidney injury molecule-1, KIM-1)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒購自武漢華美生物有限公司； RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自威佳科技有限公司；caspase-3 I 抗購自Bioworld;SCr和血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)由美國Dimendion Rxl.全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2 主要方法

2.1 分組與動(dòng)物模型的構(gòu)建 48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組(n=8)：空白對(duì)照(blank)組、假手術(shù)(sham)組、 I/R組、Cast+I/R組、EDS預(yù)處理+腎缺血再灌注(EDS+I/R)組、EDS預(yù)處理+睪酮+腎缺血再灌注(EDS+TST+I/R)組。EDS預(yù)處理為術(shù)前5 d 腹腔注射 EDS 75 mg/kg；閹割組缺血再灌注處理前15 d 摘除雙側(cè)睪丸；EDS+TST+I/R組在EDS處理后于皮下注射丙酸睪酮500 μg/kg 體重，其余各組注射等體積芝麻油，每天1次，直至缺血再灌注手術(shù)當(dāng)天?？紤]到睪酮有晝夜節(jié)律變化[5]，因此手術(shù)開始時(shí)間均為上午10時(shí)?？瞻讓?duì)照組無需手術(shù)；其余各組術(shù)前禁食6～8 h，并剃凈全腹，30 g/L戊巴比妥鈉30～50 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒鋪巾，腹正中切口，暴露雙側(cè)腎臟并游離腎蒂，假手術(shù)組僅游離雙側(cè)腎蒂，暴露45 min后縫合切口；其余組使用無損動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，45 min后取下動(dòng)脈夾，關(guān)腹。術(shù)中至蘇醒前采用電熱燈照射以維持體溫。

2.2 標(biāo)本采集 將大鼠置于代謝籠中收集術(shù)后24 h尿液標(biāo)本。術(shù)前1 h及再灌注術(shù)后24 h，于密閉容器內(nèi)用乙醚麻醉大鼠后，用直徑1.0 mm毛細(xì)玻璃管刺破大鼠眼眶后靜脈叢取2 mL 血液，取血后用灌胃針注入等體積生理鹽水。再灌注術(shù)后24 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉 50 mg/ kg 麻醉, 開腹，取雙腎組織，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)與方法

2.3.1 一般指標(biāo)的檢測(cè) LH與TST采用放射免疫法測(cè)定；SCr與BUN采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；TNF-α和KIM-1采用ELISA法測(cè)定，其中KIM-1檢測(cè)的是尿液，TNF-α和則取腎皮質(zhì)研磨上清液檢測(cè)。所有指標(biāo)的檢測(cè)均嚴(yán)格遵循說明書要求操作。

2.3.2 Fas mRNA水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。取50 mg凍存腎組織，加入1 mL Trizol 后研磨成勻漿，抽取總RNA。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用 PCR 基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)反應(yīng)30次；72 ℃ 10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。內(nèi)參照為GAPDH。以Fas與內(nèi)參照PCR產(chǎn)物的吸光度值之比來衡量Fas表達(dá)水平。引物序列見表1。

2.3.3 Caspase-3蛋白的檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)腎組織中caspase-3蛋白水平。取腎組織勻漿，提取蛋白，BCA法測(cè)量蛋白濃度。取 50 μg 樣品，以 12% SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)至 PVDF膜上， 室溫下 5% 脫脂奶粉封閉2 h，加入I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入II抗。37 ℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光。利用 Quantity One 軟件分析條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD)法。

結(jié) 果

1 建模結(jié)果分析

SD大鼠閹割后，傷口未出現(xiàn)感染，殘留陰囊無積膿積液、斜疝等情況。腎缺血再灌注造模術(shù)中，阻斷腎蒂后，腎臟變黑變暗，去除阻斷夾后顏色轉(zhuǎn)紅。術(shù)后(處死前)未出現(xiàn)大鼠死亡。EDS及閹割組術(shù)后5 d血清中已檢測(cè)不出睪酮。術(shù)后24 h摘除睪丸做HE染色，結(jié)果顯示，EDS組睪丸間質(zhì)組織可見少許殘留疏松結(jié)締組織，睪丸間質(zhì)細(xì)胞難覓蹤跡,見圖 1。

Figure 1.Representative HE staining images of rat testicles 24 h after operation(×100). Black arrow shows the Leydig cells.

2 血清睪酮水平

術(shù)前1 h，blank、sham與I/R組睪酮水平間無顯著差異(P>0.05);再灌注24 h后，sham組睪酮水平降至(1.11±0.18) μg/L，小于blank組(P<0.05)，但高于I/R組(P<0.05)。EDS+TST+I/R組術(shù)前1 h睪酮值為(0.89±0.26) μg/L，而再灌注后24 h降至(0.27±0.12) μg/L(P<0.05),見圖2。

3 血清LH的水平

Blank、sham和I/R 3組間的LH水平術(shù)前1 h及再灌注后24 h無顯著差異(P>0.05)，且都小于EDS+I/R、EDS+TST+I/R及Cast+I/R組(P<0.05)。EDS+I/R與Cast+I/R組間術(shù)前1 h、術(shù)后24 h 的LH水平均無顯著差異(P>0.05)。再灌注后24 h，EDS+I/R、EDS+TST+I/R及Cast+I/R組的LH均低于相應(yīng)術(shù)前1 h水平(P<0.05)；EDS+TST+I/R術(shù)前術(shù)后的LH值均低于EDS+I/R及Cast+I/R組(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The changes of serum testosterone 1 h before and 24 h after the surgery. Mean±SD. n= 8. *P<0.05 vs 1 h before surgery； ▲P<0.05 vs sham group； △P<0.05 vs I/R group.# Acquired values of the serum testosterone are below the minimum detectable threshold.

Figure 3.The changes of serum luteinizing hormone 1 h before and 24 h after the surgery. Mean±SD. n= 8. *P<0.05 vs I/R group group； #P<0.05 vs EDS+I/R group .

4 血清肌酐、血尿素氮、尿KIM-1及腎組織TNF-α的水平

再灌注后24 h，blank和sham組在SCr、BUN、KIM-1及TNF-α指標(biāo)上均無顯著差異(P>0.05)；EDS+I/R及Cast+I/R組的SCr水平與blank和sham組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但前2組的BUN、KIM-1及TNF-α水平顯著較高(P<0.05)；與Cast+I/R組比較，EDS+I/R組KIM-1與TNF-α水平較低(P<0.05)，而SCr和BUN在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EDS+TST+I/R組的TNF-α平均值較Cast+I/R組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。EDS+TST+I/R及I/R組的SCr、BUN與KIM-1水平均顯著高于其余4組；2組之間3種指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

5 腎組織Fas mRNA表達(dá)水平

再灌注后24 h，I/R組Fas mRNA表達(dá)水平最高，與其余各組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EDS+I/R、Cast+I/R及EDS+TST+I/R 3組Fas mRNA表達(dá)水平依次升高，各組間差異顯著(P<0.05)；Blank和sham組的Fas mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

6 腎組織caspase-3蛋白的表達(dá)

再灌注后24 h，Cast+I/R與EDS+TST+I/R組間的caspase-3/β-actin 蛋白灰度比值無明顯差異(P>0.05)。EDS+I/R組低于Cast+I/R組和EDS+TST+I/R組(P<0.05)。I/R組的caspase-3水平最高(P<0.05)。Blank和sham組間caspase-3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

討 論

雄性動(dòng)物體內(nèi)睪酮超過95%是由睪丸間質(zhì)細(xì)胞所分泌[6]，而睪酮水平對(duì)腎損傷的影響，目前還存在著爭議。有研究發(fā)現(xiàn)閹割后的雄性大鼠，腎損傷程度小于未閹割組[7]；也有研究不支持此結(jié)論[8]。本實(shí)驗(yàn)中，事先給予EDS或手術(shù)閹割降低血睪酮水平的大鼠，其腎損傷程度顯著小于對(duì)照組；而事先注射睪酮后，手術(shù)后腎臟損傷程度有所上升，這表明在腎I/R中，睪酮可能會(huì)對(duì)腎臟有著不利的影響。

EDS可以特異性地促進(jìn)成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡，因此睪酮水平大幅下降，以至在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到與手術(shù)閹割相同的效果[9]。EDS只對(duì)成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞起作用，用藥一段時(shí)間以后，睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞可重新分化為成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞，睪酮的分泌也可得到恢復(fù)，這種特性使其可在需要暫時(shí)抑制睪丸分泌睪酮時(shí)使用[10]。KIM-1是近曲小管上皮細(xì)胞中的黏附因子，尿液中KIM-1變化的特異性和敏感性都較高，可作為早期診斷腎小管損傷的指標(biāo)[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先予以EDS的大鼠，與手術(shù)閹割組相比較，腎損傷程度在血肌酐和尿素氮指標(biāo)上較為一致，而在尿液KIM-1指標(biāo)上要優(yōu)于手術(shù)閹割組。而2組在手術(shù)前、再灌注后，睪酮與黃體生成素水平均無顯著差異，提示EDS優(yōu)于手術(shù)閹割現(xiàn)象可能存在部分不依賴睪酮路徑的機(jī)制。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EDS組腎組織的TNF-α水平顯著低于閹割組，F(xiàn)as mRNA與caspase-3蛋白表達(dá)水平也較低，提示TNF-α介導(dǎo)的Fas/FasL通路可能參與該過程。

Figure 4.The effects of EDS/other processing on I/R-induced kidney injury. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs sham group； #P<0.05 vs I/R group; △P<0.05 vs EDS+I/R group.

Figure 5.The mRNA expression of Fas in the renal tissues detected by RT-PCR. Mean±SD.n=8. *P<0.05 vs sham group； #P<0.05 vs I/R group； △P<0.05 vs EDS+I/R group.

Figure 6.The protein expression of caspase-3 in the renal tissues detected by Western blotting. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs sham group； #P<0.05 vs I/R group; △P<0.05 vs EDS+I/R group.

有研究表明非特異性的創(chuàng)傷、手術(shù)等刺激也可導(dǎo)致一過性的睪酮水平下降[8]；本研究中此種現(xiàn)象得以再現(xiàn)。同時(shí)，在腎I/R過程睪酮水平的下降程度高于假手術(shù)組。此外，也有學(xué)者觀察到雄性SD大鼠在腎I/R損傷后，其睪酮水平會(huì)出現(xiàn)一過性的下降[12]。本實(shí)驗(yàn)I/R組手術(shù)前后黃體生成素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但EDS處理或手術(shù)閹割組，其術(shù)前及再灌注后24 h，黃體生成素的水平也有不同程度的下降，提示睪酮水平的下降主要是黃體生成素所致。而在下丘腦-垂體-性腺軸中，黃體生成素可受到多種因素的調(diào)節(jié)，因此腎I/R損傷影響黃體生成素的過程尚需進(jìn)一步探討。

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Effects of ethane 1,2-dimethanesulfonate preconditioning on renal ischemia/reperfusion injury in male rats

BU Chen-feng1, YU Gan-shen1, XU Yin1, SU Zhi-jian2, HUANG Ya-dong2, SU Ze-xuan1

(1DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospital,2BiopharmaceuticalResearch&DevelopmentCenter,JinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:suz2008@163.com)

AIM: To investigate the effects of ethane 1,2-dimethanesulfonate (EDS) preconditioning on renal ischemia/reperfusion (I/R) injury in male Sprague-Dawley (SD) rats. METHODS: Male SD rats (n=48) were randomly assigned to 6 groups: blank, sham, I/R, EDS+I/R, EDS+ testosterone (TST) +I/R, and castration (Cast)+I/R. The renal pedicles were bilaterally occluded with a microvascular clamp for 45 min to establish renal I/R-induced injury model. Bilateral orchiectomy was conducted 2 weeks before surgery. EDS (75 mg/kg) was intraperitoneally injected 5 d before operation. Blood samples were collected 24 h after reperfusion from the vena orbitalis posterior plexus. Luteinizing hormone (LH), TST, serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), and kidney injury molecule-1 (KIM-1) were detected. The renal tissues were harvested to measure the level of TNF-α and the expression of Fas mRNA and caspase-3 protein. RESULTS: Serum TST levels in EDS+I/R group and Cast+I/R group were below the minimum detectable threshold. Compared with other groups, the rats in EDS+I/R group and Cast+I/R group had higher levels of SCr, BUN and KIM-1 (P<0.05). SCr and BUN levels showed no significant difference between EDS+I/R group and Cast+I/R group (P>0.05), but KIM-1 level in EDS+I/R group was lower than that in Cast+I/R group (P<0.05). After reperfusion for 24 h, the levels of TST and LH in EDS+I/R group, Cast+I/R group and EDS+TST+I/R group were lower than those 1 h before operation (P<0.05). Compared with Cast+I/R and I/R group, the TNF-α level and expression of Fas mRNA and caspase-3 protein were significantly decreased in EDS+I/R group (P<0.05). CONCLUSION: EDS preconditioning substantially reduces the serum TST level, thus attenuating I/R-induced acute renal injury. TNF-α-induced Fas/FasL pathway may be involved in this process.

Ethane 1,2-dimethanesulfonate; Kidney; Kidney injury molecule-1; Testosterone

1000- 4718(2015)01- 0054- 05

2014- 06- 04

2014- 11- 18

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(No. 2007AA022006); 廣州市科技信息局基金資助項(xiàng)目(No. 11A72070508)

△通訊作者 Tel: 020-38688074; E-mail: suz2008@163.com

R363.1+3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.011