代文靜， 張 軍， 周敬群△， 向常清， 王 剛

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院 1心血管內(nèi)科， 2ICU科， 湖北 宜昌 443000)

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轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α促進(jìn)人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移和黏附*

代文靜1， 張 軍2， 周敬群1△， 向常清1， 王 剛1

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2ICU科， 湖北 宜昌 443000)

目的： 探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(transforming growth factor α，TGF-α)對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)單克隆形成、增殖、遷移和黏附細(xì)胞功能的影響及機(jī)制。方法: 分離培養(yǎng)人內(nèi)皮祖細(xì)胞，分別用濃度為1、5、10 μg/L TGF-α誘導(dǎo)處理細(xì)胞，并設(shè)置PBS對(duì)照組和表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑EGFR-TKI組(同時(shí)加入10 μg/L TGF-α和1∶1 000的EGFR-TKI)。利用單克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT法和EdU法、Transwell法和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度TGF-α對(duì)各組EPCs單克隆形成能力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移能力及黏附功能的影響；并通過Western blotting法檢測(cè)不同濃度TGF-α對(duì)各組EPCs中表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的影響。結(jié)果: 不同濃度TGF-α均能顯著誘導(dǎo)EPCs單克隆形成能力、增殖、遷移和黏附細(xì)胞功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并可以被EGFR-TKI抑制。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-α顯著誘導(dǎo)EPCs中EGFR和VEGF的表達(dá)(P<0.05)，并呈濃度依賴性。結(jié)論: TGF-α能夠顯著促進(jìn)人EPCs細(xì)胞單克隆形成、增殖、遷移和黏附相關(guān)細(xì)胞功能，并通過與EGFR結(jié)合誘導(dǎo)VEGF表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 α； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞黏附； 表皮生長(zhǎng)因子受體

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類可以分化成內(nèi)皮細(xì)胞的前體干細(xì)胞，參與到血管的新生和損傷修復(fù)，同時(shí)對(duì)于治療缺血性疾病和監(jiān)控心血管疾病具有重要應(yīng)用價(jià)值[1]。EPCs的增殖、遷移和黏附細(xì)胞功能與其在血管生成與損傷修復(fù)中發(fā)揮作用密切相關(guān)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(transforming growth factor α, TGF-α)是一種多功能性f生物活性細(xì)胞因子，在組織損傷愈合和促進(jìn)細(xì)胞分化生長(zhǎng)中發(fā)揮作用[2]。研究表明TGF-α與表皮生長(zhǎng)因子類似，通過與細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)結(jié)合發(fā)揮作用，TGF-α與EGFR具有高親和力，可激活受體內(nèi)在酪氨酸激酶活性，從而啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)TGF-α能夠促進(jìn)人脂肪來(lái)源干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞增殖和分化等細(xì)胞功能[4]。但目前關(guān)于TGF-α對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞功能的影響及其作用機(jī)制尚未見報(bào)道，因此本文通過研究TGF-α對(duì)人EPCs細(xì)胞單克隆形成、增殖、遷移和黏附功能的影響及機(jī)制，為TGF-α在血管損傷修復(fù)及缺血性血管新生中的應(yīng)用提供指導(dǎo)和依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 試劑和材料

M199細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清購(gòu)自Hyclone；青霉素、鏈霉素、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自北京碧云天公司；Endogro細(xì)胞因子、TGF-α、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)購(gòu)自R&D；D-Hanks溶液、二甲基亞砜(DMSO)、CD133磁珠購(gòu)自Sigma；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD公司；MTT試劑購(gòu)自上海生工公司；Cell-LightTMEdU熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州市銳博生物科技公司；Transwell Permeable Supports購(gòu)自Corning；兔抗人EGFR、VEGF、β-actin多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgGⅡ抗購(gòu)自中杉金橋公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 人內(nèi)皮祖細(xì)胞EPCs的分離培養(yǎng)及鑒定 取健康志愿者捐獻(xiàn)外周血，用人淋巴細(xì)胞分離液等體積混勻后密度梯度離心20 min，分離得到中間層人外周血單核細(xì)胞層。用D-Hanks液清洗并離心，棄去上清，用含10%胎牛血清和Endogro細(xì)胞因子的M199內(nèi)皮祖細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸后，接種于膠原包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h時(shí)，取出培養(yǎng)瓶換液，棄去未貼壁細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察分離的人EPCs的生長(zhǎng)狀態(tài)。EPCs培養(yǎng)至7 d時(shí)接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后加入DiI-ac-LDL(10 mg/L)，37 ℃孵育4 h后，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS漂洗后加入FITC-UEA-1(10 mg/L)，37 ℃孵育2 h后，PBS漂洗2次，在熒光顯微鏡下觀察EPCs細(xì)胞并拍照。EPCs可以攝取DiI-ac-LDL，并能特異性結(jié)合UEA-1，能同時(shí)攝取DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1標(biāo)記的確定為分化中的EPCs。

2.2 EPCs單克隆形成檢測(cè) 采用相同的方法從人外周血中分離出單核細(xì)胞層后，利用CD133磁珠分選，在4 ℃用垂直混勻器混勻30 min后收集磁珠吸附的細(xì)胞，用EPCs細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸后分成5組，分別加入濃度為1、5、10 μg/L TGF-α，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照組和表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑EGFR-TKI組(同時(shí)加入10 μg/L TGF-α和1∶1 000的EGFR-TKI)。將細(xì)胞懸液加入到甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d后，在顯微鏡下高倍視野內(nèi)隨機(jī)觀察各組中EPCs形成的單克隆并進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

2.3 MTT和Edu增殖實(shí)驗(yàn) 將連續(xù)培養(yǎng)14 d的EPCs細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，用M199內(nèi)皮祖細(xì)胞完全培養(yǎng)基稀釋至濃度為1×107/L接種在96孔板中，每孔加入200 μL。分別用含1、5、10 μg/L TGF-α的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照組和EGFR-TKI組。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)3 d后,每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，在搖床上振蕩15 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定492 nm時(shí)各孔吸光度(A)值。同時(shí)在各組96孔板中EPCs經(jīng)不同濃度TGF-α處理3 d后，每孔加入含50 μmol/L EdU培養(yǎng)基共孵育2 h，后棄培養(yǎng)基用4%多聚甲醛固定EPCs細(xì)胞，用0.2%甘氨酸孵育10 min，PBS洗滌后按照Cell-LightTMEdU方法反應(yīng)染色并在熒光顯微鏡下拍照觀察并計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野內(nèi)的增殖細(xì)胞。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)至14 d的EPCs細(xì)胞用0.25%的EDTA胰酶消化，900 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用M199內(nèi)皮祖細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸調(diào)整其濃度為1×108/L。在Transwell板培養(yǎng)室上孔中分別加入200 μL EPCs細(xì)胞懸液，下室中分別加入含PBS,1、5、10 μg/L TGF-α及TGF-α+EGFR-TKI的細(xì)胞培養(yǎng)基。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用取出上室小皿用0.1 mg/L結(jié)晶紫染色30 min，后用PBS洗滌3遍。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細(xì)胞，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并拍照。

2.5 EPCs細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)至14 d的EPCs細(xì)胞用0.25%的EDTA胰酶消化后，按照2×107/L接種于6孔板中，并用含不同濃度的TGF-α(1、5、10 μg/L)進(jìn)行培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照孔和TGF-α+GFR-TKI孔。培養(yǎng)結(jié)束后用胰酶消化各孔中EPCs細(xì)胞并離心收集。調(diào)整消化后EPCs細(xì)胞濃度一致后分別接種于人纖維連接蛋白包被的6孔板中，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，棄去培養(yǎng)基并用PBS沖洗去未貼壁的細(xì)胞，每孔在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇9個(gè)視野(×200)。同時(shí)每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，計(jì)數(shù)各組黏附的EPCs細(xì)胞。

2.6 Western blotting檢測(cè)EPCs中EGFR和VEGF表達(dá) 分離培養(yǎng)14 d的EPCs細(xì)胞用0.25%的EDTA胰酶消化后，將其分成5組，分別用含不同濃度的TGF-α(1、5、10 μg/L)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)3 d，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照組和TGF-α+EGFR-TKI組。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌后收集各組EPCs細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞中總蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定各組中蛋白濃度。每組分別取含30 μg總蛋白上樣進(jìn)行12%的SDS-PAGE分離蛋白,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉30 min后，分別孵育兔抗人VEGF I抗(1∶1 000)、EGFR I抗(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶1 000) 4 ℃過夜，用TBST洗滌3遍各5 min，后孵育HRP標(biāo)記山羊抗兔 II 抗(1∶5 000)2 h。TBST洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，曝光拍照。利用Quantity One軟件分析各條帶的相對(duì)吸光度，利用目的條帶和內(nèi)參照β-actin的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有正態(tài)分布統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人EPCs的培養(yǎng)鑒定結(jié)果

從健康人外周血中分離得到EPCs連續(xù)培養(yǎng)14 d后進(jìn)行功能鑒定。如圖1所示，所分離的人EPCs能夠吞噬DiI-ac-LDL發(fā)紅色熒光，并能夠結(jié)合FITC-UEA-1發(fā)綠色熒光，而雙陽(yáng)性黃色熒光細(xì)胞即為正在分化中的EPCs細(xì)胞。圖1中EPCs細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1雙陽(yáng)性率在90%以上，說明成功從人外周血中分離培養(yǎng)得到EPCs細(xì)胞。

Figure 1.The identification of human endothelial progenitor cells. A: FITC-UEA-1 positive cells; B: DiI-ac-LDL positive cells; C: double positive cells.

2 TGF-α對(duì)EPCs單克隆形成的影響

體外進(jìn)行EPCs的甲基纖維半固體單克隆培養(yǎng)，在7 d時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的TGF-α均能夠促進(jìn)EPCs單克隆的形成，但TGF-α對(duì)EGFR-TKI組中EPCs單克隆形成沒有作用，見圖2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，PBS對(duì)照組中每個(gè)高倍視野內(nèi)EPCs單克隆形成數(shù)為11.80±2.58，而1、5、10 μg/L TGF-α處理組中每個(gè)高倍視野內(nèi)EPCs單克隆數(shù)分別增加為20.00±2.55、26.40±2.31和34.60±2.34(均P<0.05)。同時(shí)加10 μg/L TGF-α和EGFR-TKI處理組中EPCs單克隆形成數(shù)未見增加，僅為10.60±1.82，顯著低于單獨(dú)10 μg/L TGF-α處理組，說明表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶信號(hào)途徑的抑制影響TGF-α對(duì)EPCs單克隆形成發(fā)揮作用，見圖2。

3 TGF-α對(duì)EPCs增殖的影響

MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與PBS對(duì)照組EPCs在492 nm波長(zhǎng)A值相比，1、5、10 μg/L TGF-α處理組中A值均顯著增加(P<0.05)，但同時(shí)加入10 μg/L TGF-α和EGFR-TKI組中A值無(wú)明顯變化。如圖3所示，PBS對(duì)照組中A值為0.37±0.04，而1、5、10 μg/L TGF-α處理組中A值分別增加為0.47±0.02、0.54±0.02和0.60±0.03(均P<0.05)。TGF-α+EGFR-TKI組中EPCsA值為0.33±0.02，與PBS組相比變化不明顯，但顯著低于單獨(dú)10 μg/L TGF-α處理組(P<0.05)。EdU實(shí)驗(yàn)顯示在熒光顯微鏡下增殖期EPCs發(fā)紅色熒光而其余細(xì)胞發(fā)藍(lán)色熒光，見圖4。與PBS對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度TGF-α誘導(dǎo)處理組中處于增殖期的EPCs細(xì)胞均顯著增加且呈濃度依賴效應(yīng)，但EGFR-TKI組中增殖期EPCs細(xì)胞未見明顯增加且顯著低于TGF-α單獨(dú)作用組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)高倍視野(×200)內(nèi)PBS對(duì)照組中增殖EPCs數(shù)為13.33±2.09，而1、5、10 μg/L TGF-α處理組中增殖EPCs數(shù)增加分別為27.33±1.52、32.33±1.53和45.00±2.00(均P<0.05)，TGF-α+EGFR-TKI組中增殖EPCs數(shù)為10.33±2.05，同樣顯著低于單獨(dú)10 μg/L TGF-α處理組(P<0.05)。MTT和EdU實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明TGF-α能夠促進(jìn)EPCs細(xì)胞活力和增殖，但受到EGFR-TKI的抑制。

Figure 2.The monoclonal formation of EPCs exposed to TGF-α.A: control group; B: 1 μg/L TGF-α group; C: 5 μg/L TGF-α group; D: 10 μg/L TGF-α group; E: 10 μg/L TGF-α + EGFR-TKI group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 10 μg/L TGF-α group.

Figure 3.The effect of TGF-α on the proliferation of EPCs by MTT assay. A: control group; B: 1 μg/L TGF-α group; C: 5 μg/L TGF-α group; D: 10 μg/L TGF-α group; E: 10 μg/L TGF-α + EGFR-TKI group. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 10 μg/L TGF-α group.

4 TGF-α對(duì)EPCs遷移的影響

如圖5所示，被誘導(dǎo)的EPCs細(xì)胞能夠從Transwell上室主動(dòng)遷移到下室，經(jīng)固定和結(jié)晶紫染色后可以觀察到發(fā)生遷移的EPCs細(xì)胞。與PBS對(duì)照組相比，各TGF-α處理組可以顯著誘導(dǎo)EPCs細(xì)胞遷移，但EGFR-TKI組中EPCs細(xì)胞遷移受到抑制。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，PBS對(duì)照組中平均每個(gè)高倍視野(×200)內(nèi)EPCs遷移數(shù)為38.75±4.92，而1、5、10 μg/L TGF-α處理組中EPCs細(xì)胞遷移數(shù)分別增加為63.50±3.69、75.25±2.76和90.75±3.50(均P<0.05)，EGFR-TKI組中EPCs細(xì)胞遷移數(shù)為45.00±2.16，顯著低于10 μg/L TGF-α單獨(dú)處理組(P<0.05)。

Figure 4.The effect of TGF-α on the proliferation of EPCs detected by EdU assay.A:control group; B: 1 μg/L TGF-α group; C: 5 μg/L TGF-α group; D: 10 μg/L TGF-α group; E: 10 μg/L TGF-α + EGFR-TKI group. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 10 μg/L TGF-α group.

5 TGF-α對(duì)EPCs細(xì)胞黏附能力的影響

如圖6所示，TGF-α能夠顯著提高EPCs細(xì)胞的黏附能力，并具有濃度依賴效應(yīng)。在相同時(shí)間內(nèi)，隨著TGF-α濃度的升高，EPCs細(xì)胞黏附能力提升。但TGF-α+EGFR-TKI組中EPCs細(xì)胞黏附能力未見明顯提升。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與PBS對(duì)照組中EPCs細(xì)胞黏附數(shù)30.34±4.16相比，1、5、10 μg/L TGF-α處理組中EPCs細(xì)胞黏附數(shù)分別增加為54.33±5.69、76.67±3.21和96.33±3.05(均P<0.05)，而TGF-α+EGFR-TKI組中EPCs細(xì)胞黏附數(shù)增加不明顯,為34.33±3.15，顯著低于10 μg/L TGF-α單獨(dú)處理組(P<0.05)。

Figure 5.The effect of TGF-α on the migration of EPCs detected by Transwell method.A:control group; B: 1 μg/L TGF-α group; C: 5 μg/L TGF-α group; D: 10 μg/L TGF-α group; E: 10 μg/L TGF-α+EGFR-TKI group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 10 μg/L TGF-α group.

Figure 6.The effect of TGF-α on the adhesiveness of EPCs detected by cell adhesion experiment. A:control group; B: 1 μg/L TGF-α group; C: 5 μg/L TGF-α group; D: 10 μg/L TGF-α group; E: 10 μg/L TGF-α + EGFR-TKI group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 10 μg/L TGF-α group.

6 TGF-α對(duì)EPCs細(xì)胞中EGFR和VEGF蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示,Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-α能夠誘導(dǎo)EPCs細(xì)胞中EGFR和VEGF的表達(dá)。相對(duì)PBS對(duì)照組，隨著TGF-α作用EPCs濃度的升高，EGFR和VEGF蛋白表達(dá)量也顯著上升，但EGFR-TKI組EGFR和VEGF蛋白表達(dá)量變化不明顯。經(jīng)目的蛋白EGFR和VEGF的灰度值和內(nèi)參照β-actin的比值進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)，PBS對(duì)照組EGFR相對(duì)表達(dá)量為0.15±0.03，而1、5、10 μg/L TGF-α處理組EPCs細(xì)胞EGFR相對(duì)表達(dá)量分別為0.34±0.03、0.56±0.02和0.94±0.02(均P<0.05)，但TGF-α+EGFR-TKI組EGFR相對(duì)表達(dá)量為0.18±0.02,低于10 μg/L TGF-α單獨(dú)處理組(P<0.05)；PBS對(duì)照組中VEGF相對(duì)表達(dá)量為0.33±0.02，而1、5、10 μg/L TGF-α處理組EPCs細(xì)胞VEGF相對(duì)表達(dá)量分別為0.47±0.03、0.63±0.02和0.83±0.03(均P<0.05)，但TGF-α+EGFR-TKI組VEGF相對(duì)表達(dá)量為0.36±0.02,低于10 μg/L TGF-α單獨(dú)處理組(P<0.05)。

Figure 7.The expressions of EGFR and VEGF in the EPCs exposed to TGF-α. A:control group; B: 1 μg/L TGF-α group; C: 5 μg/L TGF-α group; D: 10 μg/L TGF-α group; E: 10 μg/L TGF-α + EGFR-TKI group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 10 μg/L TGF-α group.

討 論

EPCs來(lái)源于骨髓、外周血和臍血等，可以分化成成熟內(nèi)皮細(xì)胞。近年來(lái)研究表明EPCs在心腦血管疾病、外周血疾病、血管形成及創(chuàng)傷修復(fù)中均發(fā)揮重要作用[5]，并可為缺血性疾病的研究治療提供新的思路。當(dāng)機(jī)體血管損傷或局部缺血時(shí)，EPCs可以通過增殖、遷移，黏附到血管損傷或缺血部位并直接分化成內(nèi)皮細(xì)胞，從而發(fā)揮血管修復(fù)、新生作用[6]。同時(shí)血液中EPCs數(shù)量增多時(shí)亦可以直接修復(fù)損傷的血管，因此EPCs的細(xì)胞功能發(fā)揮對(duì)于血管損傷修復(fù)和新生有重要意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子是具有廣泛生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在促進(jìn)細(xì)胞增殖分化及組織損傷愈合中均發(fā)揮作用[7]，但關(guān)于其對(duì)EPCs功能的影響及其在血管損傷修復(fù)和新生中是否發(fā)揮作用尚未知。本研究以不同濃度TGF-α誘導(dǎo)處理人外周血中分離培養(yǎng)的EPCs，進(jìn)而揭示其對(duì)EPCs增殖、遷移和黏附細(xì)胞功能的影響及機(jī)制。

通常循環(huán)EPCs在正常人血液中數(shù)量較低，而有冠心病或急性心血管疾病的病人血液中EPCs數(shù)量則更為降低,且細(xì)胞活力下降[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)血液中EPCs數(shù)量與冠心病等危險(xiǎn)因素呈負(fù)相關(guān)[9]。EPCs對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病具有獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值，其數(shù)量減少與動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重性也相關(guān)。因此，EPCs可作為心血管疾病危險(xiǎn)程度和預(yù)后的生物標(biāo)志物，調(diào)控其增殖對(duì)于治療心血管疾病有重要價(jià)值。本研究中通過EPCs的單克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-α能夠增強(qiáng)其克隆形成能力并具有濃度效應(yīng)，而MTT和EdU實(shí)驗(yàn)也顯示TGF-α能夠顯著促進(jìn)EPCs的增殖，進(jìn)而說明TGF-α能夠提升EPCs細(xì)胞活力，在EPCs增殖中發(fā)揮作用。

當(dāng)組織缺血或血管發(fā)生損傷時(shí)，EPCs能夠及時(shí)從骨髓動(dòng)員到外周血并通過遷移和黏附作用到達(dá)損傷或缺血部位分化成內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生和修復(fù)[10]。因此，EPCs的遷移和黏附細(xì)胞功能直接影響到血管的損傷修復(fù)及新生。有研究表明TGF-α能夠在組織損傷愈合中發(fā)揮重要作用[11]，但關(guān)于其對(duì)血管損傷修復(fù)中關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響尚未知。在本研究以1、5、10 μg/L 不同濃度TGF-α處理人EPCs，首次發(fā)現(xiàn)TGF-α能夠誘導(dǎo)EPCs的細(xì)胞遷移及黏附，進(jìn)而說明TGF-α能夠在血管損傷修復(fù)和血管新生中發(fā)揮積極作用。但當(dāng)10 μg/L TGF-α和EGFR-TKI同時(shí)作用于EPCs細(xì)胞時(shí)，EPCs單克隆形成及增殖、遷移和黏附能力促進(jìn)效應(yīng)均不明顯，且顯著低于10 μg/L TGF-α單獨(dú)作用組，說明TGF-α對(duì)EPCs細(xì)胞功能發(fā)揮作用與表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)途徑相關(guān)。

EGFR作為TGF-α的受體，能夠與其結(jié)合進(jìn)而激活機(jī)體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用[12]。Zhao等[13]研究也發(fā)現(xiàn)TGF-α通過與EGFR結(jié)合，使受體酪氨酸磷酸化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的因子，可以誘導(dǎo)血管的生成及新生[14]。Sufen等[15]研究已證實(shí)VEGF可以直接促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、游走遷移和黏附功能從而促進(jìn)新生血管的形成。本研究利用Western-blotting檢測(cè)不同濃度TGF-α對(duì)EPCs細(xì)胞中EGFR和VEGF表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著TGF-α處理EPCs濃度的升高，EPCs細(xì)胞中EGFR和VEGF含量也隨之顯著升高，說明TGF-α通過EGFR信號(hào)途徑對(duì)EPCs細(xì)胞發(fā)揮作用。TGF-α可以與EPCs細(xì)胞中受體EGFR結(jié)合，進(jìn)而刺激VEGF的表達(dá)，促進(jìn)EPCs的增殖、遷移和黏附等細(xì)胞功能。而在TGF-α+EGFR-TKI作用組，EPCs細(xì)胞中EGFR和VEGF表達(dá)量增加不明顯且顯著低于TGF-α單獨(dú)作用組，再次說明TGF-α對(duì)EPCs細(xì)胞功能的影響與EGFR信號(hào)途徑相關(guān)。

EPCs是治療缺血性疾病和修復(fù)血管損傷的良好種子細(xì)胞，具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。在本研究中首次發(fā)現(xiàn)TGF-α在體外能夠顯著促進(jìn)人EPCs的單克隆形成和增殖，增強(qiáng)其遷移和粘附細(xì)胞功能，誘導(dǎo)EFGR和VEGF表達(dá)發(fā)揮作用并與表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)途徑有關(guān)，對(duì)于血管損傷修復(fù)和缺血性疾病的治療具有重要意義。

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Transforming growth factor α promotes the proliferation, migration and adhesion of human endothelial progenitor cells

DAI Wen-jing1, ZHANG Jun2, ZHOU Jing-qun1, XIANG Chang-qing1, WANG Gang1

(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofICU,RenheHospital,ThreeGorgesUniversity,Yichang443000,China.E-mail:zhoujingqun-1@medmail.com.cn)

AIM: To explore the effects of transforming growth factor-α (TGF-α) in the monoclonal formation, proliferation, migration and adhesiveness of human endothelial progenitor cells (EPCs). METHODS: The isolated and cultured EPCs were treated with various concentrations of TGF-α (final concentrations of 1, 5, 10 μg/L, respectively). At the same time, the PBS control and epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) group (10 μg/L TGF-α plus 1∶1 000 EGFR-TKI) were set. The effects of TGF-α on monoclonal formation, proliferation, migration and adhesiveness of EPCs were determined by clone formation experiment, thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), EdU, Transwell and adhesion assays, respectively. The expression of epithelial growth receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were measured by Western blotting. RESULTS: Different concentrations of TGF-α all significantly induced the monoclonal formation, proliferation, migration and adhesiveness of EPCs (P<0.01), which were inhibited by EGFR-TKI. The results of Western blotting showed that TGF-α also induced the expression of EGFR and VEGF with a certain concentration effect (P<0.01). CONCLUSION: By combining with EGFR induced the expression of VEGF, TGF-α significantly promotes the related cell function of monoclonal formation, proliferation, migration, adhesiveness in EPCs.

Transforming growth factor α; Human endothelial progenitor cells; Cell proliferation; Cell migration; Cell adhesion; Epidermal growth factor receptor

1000- 4718(2015)01- 0033- 07

2014- 08- 22

2014- 11- 01

教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. D20091308)

△通訊作者 Tel: 0717-6555730; E-mail: zhoujingqun-1@medmail.com.cn

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.007