易樂飛，郝 偉，李信書，閻斌倫

( 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005 )

條斑紫菜Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因克隆與分析

易樂飛，郝 偉，李信書，閻斌倫

( 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005 )

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是動(dòng)植物重要的解毒酶，分布廣泛，類型眾多。本研究利用生物信息學(xué)方法和RT-PCR技術(shù)獲得了條斑紫菜一條新谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(PyGST2)基因的cDNA序列，該基因含有完整的開放閱讀框，并且受到鉛脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。PyGST2蛋白具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的保守結(jié)構(gòu)域和保守氨基酸殘基，與Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的序列一致性最高，與Alpha、Sigma和Pi型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的次之，在進(jìn)化樹上遠(yuǎn)離高等植物的各型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，而與動(dòng)物的Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶聚為一支。該Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的克隆為后續(xù)研究條斑紫菜抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

條斑紫菜；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；克隆；表達(dá)

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST，E.C2.5.1.18)是一類分布廣泛且功能多樣的蛋白超家族[1]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶主要負(fù)責(zé)催化還原型谷胱甘肽與非極性化合物結(jié)合，因此谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的主要功能是通過硫醚氨酸途徑參與外源性有毒物質(zhì)的解毒過程[2]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶還參與了內(nèi)源性過氧化物的清除、芳香族氨基酸的降解、類固醇激素的合成、花生四烯酸的合成與失活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[2-3]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白家族成員間序列相似性低，型別眾多。根據(jù)氨基酸序列一致性、基因結(jié)構(gòu)和免疫活性等將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族成員進(jìn)行了分類，哺乳動(dòng)物可溶性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶分為Sigma、Theta、Zeta、Omega、Alpha、Mu和Pi型，植物可溶性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶分為Theta、Zeta、Lambda、Phi、Tau和DHAR(dehydroascorbate reductases)型，昆蟲可溶性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶分為Sigma、Theta、Zeta、Omega和Delta型，細(xì)菌可溶性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶分為Theta和Beta型[4]。有些谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶型別是各類生物共有的，有些是特異的，比如Alpha、Mu和Pi型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶為動(dòng)物特有。與高等動(dòng)植物相比，藻類(特別是海藻)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶研究相對薄弱。2008年Hervé等[5]首次對藻類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果顯示紅藻和褐藻的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與高等植物所有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，而與動(dòng)物的Sigma型親緣關(guān)系較近，并指出這些藻類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)新類型。

紅藻在進(jìn)化上分化早，較為原始[6]，這暗示著紅藻可能還具有不同于高等植物的新的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶類型。為了驗(yàn)證這一推測，筆者以紅藻中較原始的條斑紫菜(Pyropiayezoensis)為材料，綜合運(yùn)用生物信息學(xué)和RT-PCR技術(shù)手段，克隆和分析了條斑紫菜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)新成員，并命名為PyGST2。與預(yù)期相符，PyGST2與高等植物所有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，而與動(dòng)物的Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶親緣關(guān)系較近。暗示著條斑紫菜可能具有不同于高等植物的解毒機(jī)制，該Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的克隆為后續(xù)研究條斑紫菜抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從連云港高公島紫菜養(yǎng)殖筏上采集條斑紫菜葉狀體。在室內(nèi)充氣培養(yǎng)，控制培養(yǎng)溫度為10 ℃、光照為100 μmol/m2·s、光周期為12L∶12D。暫養(yǎng)5 d后進(jìn)行鉛脅迫處理，Pb2+質(zhì)量濃度為10 mg/L，處理2、6 h和12 h后取樣，以不脅迫的為對照。

1.2 總RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄

用TRIzol試劑(Invitrogen)抽提條斑紫菜葉狀體總RNA，接著用DNase Ⅰ(MBI Fermentas)處理總RNA，以降解殘留在總RNA中的gDNA。純化后的總RNA用普通瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀(Bio-Rad)檢測完整性和純度。以RandomPrimer為反轉(zhuǎn)錄引物，用RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas)對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cDNA。

1.3 基因克隆與序列分析

[7]的方法對PyGST2進(jìn)行電子克隆，從GenBank的EST數(shù)據(jù)庫中篩選出了27條條斑紫菜EST序列，這些EST拼接后得到了1條長1045 bp的contig序列。根據(jù)電子克隆結(jié)果設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′TGGTTCGACACGCTTTCC 3′，下游引物：5′CCCTCGCCTGCTCACAT 3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長838 bp，包含PyGST2的完整編碼區(qū)。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包含2 μL 10×PCR buffer、2 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP、500 nmol/L上下游引物、1 U Dream Taq(MBI Fermentas)和1 μL第一鏈cDNA。PCR反應(yīng)條件為：先95 ℃預(yù)變性5 min，然后循環(huán)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測并送上海生工測序，測得的序列已提交至GenBank，索引號為HM182105。

采用DNAStar軟件分析PyGST2的基本理化特性，使用Blast[8]和CDD[9]對PyGST2保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析。參考Hervé等[5]的方法，選取了人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、斑馬魚(Daniorerio)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)以及多種藻類的各型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶共計(jì)93條谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與PyGST2一起進(jìn)行了多對序列比對，多序列比對采用用MAFFT[10]進(jìn)行。鑒于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族龐大、成員間相似性低，所以采用PhyML[11]構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 表達(dá)分析

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測PyGST2基因在重金屬脅迫下的表達(dá)。定量PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包含10 μL 2×SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)、300 nmol/L正向引物(5′ GGGTCATCCTCCGCTTCATCG 3′)、300 nmol/L反向引物(5′ CGCCGCCTCCATATCCTCTG 3′)和1 μL第一鏈cDNA。在IQ5 PCR儀(Bio-Rad)上進(jìn)行擴(kuò)增，先95 ℃預(yù)變性30 s，然后循環(huán)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性10 s，63 ℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后，制作熔解曲線。內(nèi)參基因及其定量檢測方法參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)設(shè)陰性對照和無模板對照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用LinRegPCR[13]計(jì)算擴(kuò)增效率，用Pfaffl[14]建立的數(shù)學(xué)模型對定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 PyGST2克隆及基本理化性質(zhì)

PyGST2的cDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)一條長約800 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小接近。在此cDNA序列上起始密碼子(AUG)旁側(cè)序列符合典型的kozak規(guī)則，cDNA序列上包含一個(gè)長654 bp的完整編碼區(qū)，編碼蛋白長217 AA。PyGST2蛋白分子量為24.6 ku，其堿性、酸性、疏水性和極性氨基酸含量分別為25、37、80和36個(gè)，等電點(diǎn)為4.86。PyGST2第1～78位氨基酸序列構(gòu)成谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的N端結(jié)構(gòu)域，其屬于類硫氧還蛋白超家族，含有谷胱甘肽特異結(jié)合位點(diǎn)；第89～198位氨基酸序列構(gòu)成C端結(jié)構(gòu)域，含有結(jié)合疏水底物的位點(diǎn)(圖1)。

2.2 PyGST2型別

首先用Blast程序初步分析了PyGST2的型別，即用PyGST2的氨基酸序列對GenBank中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp搜索，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)庫中與PyGST2比對上的序列全部都是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，而且在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的各種型別中，Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與PyGST2比對得到的E值相對較小，序列一致性相對較大。

圖1 PyGST2的保守結(jié)構(gòu)域

在參與比對的各型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶中，PyGST2與條斑紫菜另一條谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶序列(GQ415054)的序列一致性并不高，僅為21.3%，與植物的各型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的序列一致性也不高。相反，與動(dòng)物Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的序列一致性最高，為23.2%～29.4%；與動(dòng)物Alpha、Sigma和Pi型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的序列一致性次之，為18.8%～26.2%；與藻類的類Sigma型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的序列一致性為21.3%～27.1%；與其他型別的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶序列一致性為11.5%～20%。

在多序列比對的基礎(chǔ)上構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，在進(jìn)化樹上所有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶首先按型別聚類，然后才是按物種類別聚類，即不同物種來源的同型別谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶都單獨(dú)聚類在一起。第一個(gè)被克隆的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GQ415054)與其他藻類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶以及Sigma型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶聚為一支，共同構(gòu)成了Sigma型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。本克隆的PyGST2與紅藻(Cyanidioschyzonmerolae)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(XP_005539154)以及Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶聚為一支。這些數(shù)據(jù)清楚地表明PyGST2屬于Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族成員之一。

圖2 不同型別谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)化樹用PhyML構(gòu)建了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族成員的進(jìn)化樹，節(jié)點(diǎn)前的數(shù)值表示分支的統(tǒng)計(jì)支持率，GenBank索引號和物種名一并顯示在圖上.

2.3 PyGST2的定量表達(dá)

定量PCR儀記錄到的擴(kuò)增曲線呈規(guī)則的“S”形，溶解曲線呈現(xiàn)單一特異峰，PyGST2基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率分別是1.894和1.895，無模板對照的擴(kuò)增曲線呈水平直線，這些表明定量檢測體系性能良好。條斑紫菜葉狀體在Pb2+脅迫2、6 h和12 h后，PyGST2基因的表達(dá)量上升，分別是對照的1.75、1.25和1.51倍(圖3)，表明PyGST2基因表達(dá)受到重金屬脅迫的誘導(dǎo)。

圖3 條斑紫菜PyGST2基因在重金屬脅迫下的相對表達(dá)量

3 討 論

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是一個(gè)龐大的蛋白超家族，其成員間的序列組成變異較大，例如水稻的Phi型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶成員間的序列一致性23%～82%，通常同一型別谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶成員間的平均序列一致性略高于40%，不同型別谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶成員間的序列一致性在動(dòng)物中通常小于25%，在植物中小于20%[4]。雖然不同谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的序列差異很大，但其彼此間仍具有一些共同的特征。首先，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶具有非常相似的二級和高級結(jié)構(gòu)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶一般以二聚體形式出現(xiàn)，每個(gè)亞基都包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于N端，比較保守，由β折疊和α螺旋構(gòu)成類硫氧還蛋白折疊(βαβαββα)，含有谷胱甘肽特異結(jié)合位點(diǎn)以及保守的絲氨酸或酪氨酸殘基；結(jié)構(gòu)域Ⅱ位于C端，變異較大，由4～7個(gè)α螺旋構(gòu)成，含有結(jié)合疏水底物的位點(diǎn)[1,3-4]。其次，相似的二級和高級結(jié)構(gòu)暗示著這些序列差異較大的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶都執(zhí)行著相似的功能，即在功能上谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶主要參與解毒過程。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶能催化有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基結(jié)合，形成更易溶解且無毒性的衍生物，便于其排出體外或分解[1,4]。多序列比對結(jié)果清晰地顯示PyGST2與其他谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶具有較低的序列一致性，因此為了充分確認(rèn)PyGST2就是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的成員之一，本文也從二級結(jié)構(gòu)和生理功能這兩個(gè)層面上開展了研究。在二級結(jié)構(gòu)方面，PyGST2具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的2個(gè)結(jié)構(gòu)域和保守的氨基酸殘基，在生理功能方面，PyGST2基因受到重金屬脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，這些數(shù)據(jù)清楚地表明PyGST2是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的成員之一。

1961年Booth等[15]首次在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，隨后1970年Frear等[16]在植物中也發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。之后的40年里從動(dòng)植物和微生物中分離鑒定了大量的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，于是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分類也就隨之展開。隨著新的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的不斷發(fā)現(xiàn)，對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分類也在不斷發(fā)展和變化著。以植物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶為例，最初植物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶均歸類于異質(zhì)性較高的Theta型，隨著測序計(jì)劃的開展更多植物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶被克隆，于是1997年植物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶被分成了3類(即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，即后來的Phi、Zeta和Tau型)，次年新增了第4類(即Ⅳ型，Theta型)，2002年又新增了Lambda型和DHAR[17]。雖然早期的研究認(rèn)為只有動(dòng)物才具有Sigma型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，只有哺乳動(dòng)物具有Alpha、Mu和Pi型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[4]，但是上述谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶分類研究主要集中在動(dòng)植物，缺乏對低等藻類的研究。2008年Hervé等[5]開展了紅藻和褐藻谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分類研究，并指出這些藻類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)新類型。隨后周向紅等[12]的研究也支持了這一觀點(diǎn)，認(rèn)為這些藻類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶屬于Sigma型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。本研究得到的進(jìn)化樹與Hervé等[5,15]的結(jié)果基本一致，不僅支持了藻類也含有Sigma型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的觀點(diǎn)，而且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了條斑紫菜等紅藻還含有Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。條斑紫菜Mu型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的克隆不僅完善了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分類研究，還暗示著條斑紫菜可能具有與高等動(dòng)物類似的解毒機(jī)制，為后續(xù)的條斑紫菜抗逆研究奠定了基礎(chǔ)。

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CloningandAnalysisofaMuClassGSTinLaverPorphyrayezoensis

YI Lefei,HAO Wei,LI Xinshu,YAN Binlun

( School of Marine Science & Technology,HuaiHai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China )

Glutathione S-transferases (GSTs) are cellular multifunctional detoxification enzymes,and ubiquitously found in all types of organisms with a highly diverse family of proteins.In the present study,a novel member (PyGST2) of GST family in laverPorphyrayezoensisUeda was cloned and analyzed using RT-PCR and bioinformatical tool.It was found that PyGST2 gene contained a continuous complete open reading frame encoding a polypeptide of 217 amino acids.The Pb2+stress induced the expression of PyGST2 gene which contained conserved domains and amino acid residues of GST family.PyGST2 shared the highest identities with Mu class GSTs,and higher identities with Alpha,Sigma and Pi class GSTs among all kinds of GSTs.Phylogenetic analysis showed that PyGST2 was distinct from GST class of plant,but was most closely related to the Mu class GSTs.The findings of PyGST2 laid the foundation for further understanding of the molecular mechanisms of stress tolerance in the laver.

Porphyrayezoensis;GST;cloning;expression

Q785

A

1003-1111(2016)01-0067-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.012

2015-04-22；

2015-08-31.

江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(2012HS013).

易樂飛(1975-)，男，碩士，副教授；研究方向：水生生物分子遺傳.E-mail:yilf@hhit.edu.cn.通訊作者：閻斌倫(1962-)，男，教授;研究方向：海洋生物應(yīng)用技術(shù).E-mail：yanbinlun1962@163.com.