王軍，李光明，仝艷艷，鄧怡林，吳劼，范建高

新型異喹啉類化合物12-4-Y對活化肝星狀細胞凋亡的影響及其機制研究*

王軍，李光明，仝艷艷，鄧怡林，吳劼，范建高

作者單位：200092上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科（王軍，李光明，范建高，仝艷艷，鄧怡林）；復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系（吳劼）

第一作者：王軍，女，26，碩士研究生。主要從事肝損傷及肝纖維化的防治研究，E-mail: nalanxuehai@126.com

【摘要】目的探討新型異喹啉類化合物12-4-Y[1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并（5，1-a）異喹啉]對大鼠肝星狀細胞（HSC）凋亡的影響，并探討其可能的機制。方法以不同濃度（5、10、20、40和80 μg/ml）12-4-Y處理HSC-T6細胞，分別于孵育后12h、24h、36h和48h收集細胞，以MTT法檢測細胞增殖，以Hoechst染色對凋亡定性，以流式細胞分析對凋亡定量，應(yīng)用Western blot檢測凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3表達變化。結(jié)果12-4-Y處理12h可濃度依賴性（在5～80 μg/ml范圍內(nèi)）抑制HSC-T6細胞增殖，細胞增殖率分別為（1.086±0.013）、（1.055±0.019）、（0.957±0.012）、（0.793±0.021）和（0.553±0.031），均顯著高于對照組水平（1.215±0.014，P<0.05）；12-4-Y（20μg/ml）處理可時間依賴性抑制HSC-T6細胞增殖，在12 h、24 h、36 h、48 h，細胞增殖率分別為（0.957±0.012）、（0.852±0.024）、（0.641±0.032）和（0.492±0.017），與對照組（1.318±0.007，P<0.01）差異具有顯著性；12-4-Y（20μg/ml）處理24h時，Hoechst染色顯示HSC-T6可見明顯凋亡小體，流式細胞分析顯示凋亡率為（29.23±1.20）%，顯著高于對照組[（5.47±1.39）%，P<0.001]；蛋白質(zhì)印跡顯示凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3的裂解產(chǎn)物表達亦顯著增加。結(jié)論新型異喹啉類化合物12-4-Y可顯著誘導(dǎo)活化HSC凋亡，其機制與激活凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝星狀細胞；異喹啉類化合物；凋亡；凋亡小體

既往研究表明，異喹啉類化合物具有抑制星形膠質(zhì)細胞增殖[1]，誘導(dǎo)前列腺癌細胞、肝癌細胞和骨肉瘤細胞凋亡等多種生物學(xué)活性[2～6]。近來，亦有研究證實異喹啉類生物堿可誘導(dǎo)HSC凋亡，從而能逆轉(zhuǎn)或延緩肝纖維化的進展[7，8]。1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并（5，1-a）異喹啉（12-4-Y）是一種新型的異喹啉類小分子化合物，本研究旨在探討12-4-Y對肝HSC增殖及凋亡的影響，以明確12-4-Y潛在的抗肝纖維化的作用及其機制。

1　材料與方法

1.1細胞、儀器與試劑大鼠肝星狀細胞系HSC-T6細胞購自美國典型培養(yǎng)物中心（American Type Culture Collection，ATCC），全波長酶標儀（Bio-TEK公司），DMI300B型倒置熒光顯微鏡（Leica公司），F(xiàn)ACS cantoⅡ檢測型流式細胞儀（BD公司），Chemi Doc XRS凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。本研究所選用的12-4-Y是從復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系合成的“類天然產(chǎn)物”化合物庫中篩選出來的，用DMSO配制成200 μg/ml

濃度的原液，用含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成200 μg/ml濃度的母液，0.22 μm的無菌濾器過濾除菌后4℃保存?zhèn)溆茫R用前用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。DMEM（高糖）培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA購自美國Gibco公司；6孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板購自美國Corning Costar公司，F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測試劑購自美國BD公司；兔抗鼠Caspase3單克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司；Millipore ECL發(fā)光液購自德國Merck公司；變性型裂解液、Hoechst33342染色液、二抗檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2細胞的培養(yǎng)取大鼠肝星狀細胞系HSC-T6細胞，置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，待細胞長至80%~90%密度時，用0.02%EDTA 和0.25%胰蛋白酶消化，按1:4傳代。取對數(shù)生長期的細胞，計數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板（8000個/孔）、24孔培養(yǎng)板（1×105個/孔）和6孔板（5×105個/孔），放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育16～24h，待細胞貼壁后處理細胞。

1.3 HSC-T6細胞增殖檢測采用MTT法，取HSCT6細胞接種于96孔板，以2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml和80 μg/ml 12-4-Y處理貼壁培養(yǎng)的HSC-T6細胞，同時設(shè)空白對照組，分別于孵育后12 h、24 h、36 h和48 h，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4h，棄MTT，加入DMSO150 μl，37℃孵育10 min，于波長562 nm 測OD值。采用臺盼藍染色進行細胞活力評估。

1.4凋亡小體檢測采用Hoechst染色法，取HSC-T6細胞，接種于24孔板。根據(jù)臺盼藍染色和MTT檢測篩選的結(jié)果，選用細胞毒性小及抑制效果明顯的3個藥物作用濃度（5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml）處理HSC-T6細胞24 h，設(shè)空白對照組。然后，棄培養(yǎng)基，以DPBS洗1遍，加入4%多聚甲醛固定15 min，以DPBS洗2遍，每次3min，加入適量的Hoechst染色液對凋亡細胞及細胞核進行染色[9～11]，室溫避光孵育20 min，DPBS洗2遍，每次3min，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5細胞凋亡定量分析取HSC-T6細胞，接種于6孔板，分別予以5 μg/ml、10 μg/ml和20 μg/ml濃度的12-4-Y處理HSC-T6細胞24 h，設(shè)空白對照組。分別收集各組細胞，1000 r/m離心5 min，棄上清液，用冷的DPBS洗滌2次，并在含有Ca2+的染色緩沖液中以1×106/ml重懸細胞。在室溫下，吸取100μl細胞（1×105）至試管中，設(shè)置空白對照組、空白單標組（AnnexinⅤ-FITC）或碘化丙啶（PI），其余各組分別加入AnnexinⅤ-FITC染液和PI各5 μl，輕輕混勻，37℃下避光孵育15 min，加入400 μl的結(jié)合緩沖液，混勻后，30 min內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.6細胞Caspase3及其活化形式的檢測取HSC-T6細胞，接種于6孔板，分別予以5 μg/ml、10 μg/ml 和20 μg/ml濃度的12-4-Y處理HSC-T6細胞24h，設(shè)空白對照組。分別收集各組細胞，提取總蛋白，進行Caspase3及活化的Caspase3蛋白表達情況的檢測。主要步驟如下：以RIPA裂解液裂解各組細胞（1×107細胞/ml），加入蛋白酶抑制劑PMSF 10 μl/ml，冰上靜置15 min，15000 r/m 4℃離心15 min，取上清，轉(zhuǎn)入新的EP管中，用蛋白質(zhì)定量試劑對每個樣品的總蛋白進行定量，加入5×SDS凝膠電泳上樣緩沖液，沸水浴5min，待蛋白樣品變性后置于-80℃保存。取各組總蛋白60 μg，灌制12%SDS-PAGE分離膠和4%濃縮膠，加樣，80 v電泳至分界處，換成120 v直至溴酚藍跑至膠底部；300 mA、40 min轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含5%脫脂奶粉、0.1%Tween20的TBST封閉液室溫下封閉2 h；將PVDF膜在含有各抗體的一抗稀釋液（1:1000）中4℃孵育過夜。同時使用小鼠抗大鼠Tublin單克隆抗體（1:1000）孵育作為對照；置于洗膜液（含0.1%Tween20的TBS）中洗膜3次，每次10 min；將膜置于HRP標記的山羊抗兔IgG（H+L）或山羊抗小鼠IgG（H+L）的二抗稀釋液（1:1000）中在搖床上震蕩孵育2h；洗膜液洗膜3次，每次15min。暗室中將膜加上ECL發(fā)光劑，鋪上保鮮膜，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用Turkey's檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 12-4-Y可明顯抑制HSC-T6細胞增殖MTT檢測結(jié)果顯示，在12～48h內(nèi)，2.5～80 μg/ml 12-4-Y 對HSC-T6細胞增殖的抑制呈濃度及時間依賴性增加（圖1），與對照組比，在5～40 μg/ml范圍內(nèi)其作用具有顯著性差異。臺盼藍染色結(jié)果顯示，與對照組比，12-4-Y在40 μg/ml以上和20 μg/ml孵育24h可誘導(dǎo)細胞活力明顯下降，漂浮細胞增加，差異具有顯著性（P<0.05）；在其余濃度及孵育時間組，12-4-Y處理組與對照組相比，細胞活力下降無顯著性差異。

2.2 12-4-Y可誘導(dǎo)HSC-T6細胞凋亡經(jīng)Hoechst染色顯示，孵育24 h，與對照組比，5～20 μg/ml 12-4-Y均可明顯誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡小體（圖2），表明12-4-Y可誘導(dǎo)HSC T6凋亡。

2.3凋亡定量情況流式細胞分析是一種細胞凋亡的定量評估方法，并可區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡。在流式細胞儀分析中，2象限提示晚期凋亡和壞死細胞，4象限提示早期凋亡。經(jīng)流式細胞分析顯示，在孵育24 h時，5～20 μg/ml范圍內(nèi)12-4-Y作用下，細胞凋亡呈濃度依賴性增加；與對照組比，在5～20 μg/ml濃度范圍內(nèi)，細胞凋亡增加具有顯著性差異，并顯示20 μg/ml較5～10 μg/ml濃度作用造成早期凋亡比例明顯增加，20 μg/ml12-4-Y作用下，細胞總凋亡率為（29.2±1.2）%，與對照組（5.47±1.39）%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖3）。

2.4 12-4-Y可誘導(dǎo)活化的Caspase3表達上調(diào)Caspase3是一種凋亡關(guān)鍵蛋白，cleaved caspase3是Caspase3的活化形式。經(jīng)Western blot檢測顯示，與對照組比，12-4-Y可明顯上調(diào)活化Caspase3表達，表明12-4-Y誘導(dǎo)的HSC-T6細胞凋亡可能與活化caspase3有關(guān)（圖4）。

3　討論

活化的HSC清除障礙是肝纖維化持續(xù)進展的主要原因，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡是防治肝纖維化的一種有效策略[9~12]。異喹啉生物堿具有明顯誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖、抗炎等多種作用[13，14]。通過對異喹啉類生物堿改造修飾，保留其促凋亡活性并降低細胞毒性，有望創(chuàng)造出一類新型抗肝纖維化藥物的先導(dǎo)化合物。

我們先前從近200種異喹啉生物堿中初篩出對HSC-T6細胞增殖具有明顯抑制作用的12-4-Y，為了評估12-4-Y對HSC-T6細胞凋亡的影響，我們應(yīng)用Hoechst染色對細胞凋亡進行定性，流式細胞分析對細胞凋亡進行定量，從而進一步證實12-4-Y在5～20 μg/ml濃度孵育24 h可濃度依賴性誘導(dǎo)細胞凋亡，20 μg/ml孵育24 h時細胞凋亡率達到近30%。Caspase3活性裂解產(chǎn)物的同步增加進一步論證了凋亡的存在，并提示12-4-Y誘導(dǎo)的HSC-T6細胞凋亡與激活凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3有關(guān)[15，16]。

文獻報道，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡是粉防己堿抗肝纖維化重要的作用機制之一。通過對異喹啉類天然活性成分進行修飾，進而合成毒性低而生物活性強的新型異喹啉小分子化合物，可能是探尋抗肝纖維化先導(dǎo)化合物的一種有效方法。

我們的研究篩選到一種新型異喹啉類化合物（12-4-Y），發(fā)現(xiàn)12-4-Y誘導(dǎo)HSC凋亡的有效濃度，證實并初步闡明了12-4-Y誘導(dǎo)HSC凋亡的機制與激活凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3有關(guān)，提示12-4-Y有潛力成為一類新型抗肝纖維化先導(dǎo)化合物。

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（收稿：2014-12-02）

（本文編輯：陳從新）

·實驗性肝炎·

Mechanism of 12- 4- Y，a novel isoquinoline compound，on apoptosis of activated hepatic stellate cells in

vitro

Wang Jun，Li Guangming，Tong Yanyan，et al. Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital Affiliated to

Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

【Abstract】Objective To study the mechanism of 12-4-Y[1-ethyl -8- methoxy -5 phenyl pyrazole（5，1-a）isoquinoline]，a novel isoquinoline compound，on apoptosis of activated rat hepatic stellate cells（HSCs）in vitro. Methods HSCs-T6 cells were treated with 12-4-Y at different concentrations（5，10，20，40 and 80 μg/ml）for 12 h，24 h，36 h and 48 h，respectively. Cell proliferation was determined by MTT assay. Qualitative and quantitative cell apoptosis were measured by Hoechst staining and flow cytometry（FCM），respectively. The expression of caspase 3 and its active form were detected by Western blotting. Results The proliferation rates of HSC-T6 cells when incubated with 12-4-Y for 12 hours were dose-dependent decreased[（1.086±0.013），（1.055±0.019），（0.957±0. 012），（0.793±0.021）and（0.553±0.031），significantly lower than that in control group（1.215±0.014），P<0.05 for all]；the time-dependent inhibition of cell proliferation was observed when the incubation concentration of 12-4-Y at dose of 20 μg/ml was fixed[（0.957±0.012），（0.852±0.024），（0.641±0.032）and（0.492±0.017）at 12 h，24 h，36 h and 48h，significantly lower than that in the control group（1.318±0.007），P<0.01 for all]；In cells treated with 20 μg/ml for 24h，the apoptotic rate revealed by flow cytometry analysis was（29.23±1.20）%，which was significantly higher than that in the control group [（5.47±1.39）%，P<0.001]and Hoechst staining showed obvious apoptotic bodies in HSCs-T6 cells，in addition，Western blotting analysis revealed increased expression of cleaved caspase3 compared with in the control group. Conclusion 12-4-Y has great potential in inducing HSCs apoptosis and the activation of caspase3 might be involved in this process.

【Key words】Hepatic stellate cells；Isoquinoline compound；Apoptosis，Apoptosis body

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.003

通訊作者：李光明，E-mail: ligm68@126.com

*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81070344）；中國肝炎基金會王寶恩肝纖維化研究基金資助項目（200090007）