張寧寧綜述，陸偉審校

腫瘤患者血清線粒體肌酸激酶水平變化及其診斷意義研究進展*

張寧寧綜述，陸偉審校

【摘要】線粒體肌酸激酶（MtCK）存在于細胞內(nèi)線粒體內(nèi)膜和外膜間隙，屬肌酸激酶同工酶系列，其主要生理作用是在有氧情況下通過磷酸肌酸穿梭機制提供肌肉收縮所需能量。近年來，很多研究發(fā)現(xiàn)MtCK在腫瘤患者血清中高表達，且大多數(shù)是患有惡性腫瘤患者的血清中MtCK呈高表達，在預(yù)后不好的病人中過表達尤其明顯，推測其對惡性腫瘤的臨床診斷及預(yù)后判斷具有重要意義。同時，分子生物學(xué)研究認(rèn)為MtCK過表達可以使細胞在某種程度上獲得一定的生長優(yōu)勢以抵抗調(diào)亡。

【關(guān)鍵詞】腫瘤；線粒體肌酸激酶；臨床診斷

線粒體肌酸激酶（Mitochondrial creatine kinase，MtCK），與胞漿型的腦型肌酸激酶（Brain type creatine kinase，CKBB）、肌型肌酸激酶（Muscle creatine kinase，CK-MM）、雜合型肌酸激酶（Muscle and brain creatine kinase，CK-MB）共同組成了肌酸激酶同工酶家族。MtCK、CK-MM、肌酸（creatine，Cr）及磷酸肌酸（Phosphocreatine，PCr）在機體內(nèi)共同組成了對細胞和組織的能量代謝起關(guān)鍵的作用的細胞內(nèi)能量緩沖及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，即肌酸激酶/磷酸肌酸循環(huán)（CK/PCr循環(huán)）。MtCK存在于細胞內(nèi)線粒體內(nèi)膜和外膜間隙，在線粒體崩解破壞時，線粒體的小碎片入血，使MtCK呈低聚狀態(tài)，約占總活性的20%。MtCK在參與能量代謝及肌肉收縮[1]同時，還參與催化三磷酸腺苷（Triphosadenine，ATP）和肌酸之間高能磷酸鍵的可逆裝換，有利于ATP水平在時間和空間上進行緩沖與再生。

MtCK是兩個相等的亞基組成的單體基礎(chǔ)上形成二聚體和八聚體的形式，分子量86~340kD，其分子量雖然與胞漿來源的同工酶相等，但MtCK的一級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、動力學(xué)性質(zhì)均與胞質(zhì)型的肌酸激酶同工酶不同。其主要生理作用是在有氧情況下，通過磷酸肌酸穿梭機制提供肌肉收縮的能量，在線粒體呼吸控制中起重要作用[2，3]。MtCK以兩種組織特異的亞型存在，即MtCK的廣泛型亞型（Ubiquitous MtCK，uMtCK）和肌節(jié)型亞型（Sarcomeric MtCk，sMtCk）。uMtCK分布于平滑肌、腦、腎等其他組織，sMtCK僅在橫紋肌中表達。編碼uMtCK的氨基酸基因序列和編碼sMtCK的氨基酸基因序列82%~85%同源[4]。近年來，很多研究發(fā)現(xiàn)MtCK在腫瘤患者血清中高表達，并研究其相關(guān)分子生物學(xué)機制，推測其對癌癥的臨床診斷具有重要意義，現(xiàn)對其在腫瘤臨床診斷及相關(guān)分子生物學(xué)機制研究進展綜述如下。

1　MtCK在腫瘤組織中的表達

1979年Homburger發(fā)現(xiàn)在小細胞肺癌與前列腺癌患者血清MtCK高表達，之后人們發(fā)現(xiàn)在其他腫瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)其高表達，推測MtCK的含量對癌癥的臨床診斷具有重要意義。根據(jù)MtCK的兩種亞型的組織分布，推測腫瘤中出現(xiàn)的MtCK的亞型應(yīng)多為uMtCK亞型。uMtCK在血清中被發(fā)現(xiàn)其表達的過程很有趣，胞漿中的肌酸激酶可以分為B型（brain，腦型）和M型（muscle，肌型），它們分別以CK-MM、CK-BB和CK-MB的形式存在，CK-MB是臨床心肌梗塞的常用標(biāo)志物，心肌細胞中是沒有CK-BB表達的，但是心肌細胞富含CK-MM和CK-MB，臨床檢測常用免疫抑制法特異地抑制M型肌酸激酶活性，并將檢測到的B型肌酸激酶活性乘以2即為CK-MB活性，臨床發(fā)現(xiàn)部分患者血清中CK-MB活性異常升高，后來將CK同工酶應(yīng)用蛋白電泳法檢測，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用免疫抑制法檢測的部分CK-MB異常升高患者的血清中含有uMtCK，uMtCK的CK活性在免疫抑制法中不會被抑制，則會被誤以為是B型活性，導(dǎo)致CK-MB活性出現(xiàn)異常升高。更重要的發(fā)現(xiàn)是，大多數(shù)都患有惡性腫瘤患者的血清中uMtCK呈高表達，這說明uMtCK的高表達可能與腫瘤高度的能量需求有關(guān)[5]。國內(nèi)外研究表明，惡性腫瘤病人中有uMtCK的過表達，比如肺癌、淋巴瘤、乳腺癌等各種惡性腫瘤和一部分腫瘤化療患者[6，7]，在預(yù)后不好的病人中過表達尤其明顯[8]。

1.1肺癌Lee YC et al[9]選擇原發(fā)性肺癌患者、肺炎癥性疾病患者及正常人血清共42例，檢測MtCK在血清中的陽性率分別為56.8%、29.6%和0，原發(fā)性肺癌患者血清中MtCK的陽性率高于癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA）的陽性率，對于手術(shù)切除術(shù)前MtCK陽性的患者，其切除術(shù)后患者血清中MtCK陰轉(zhuǎn)，病理為原發(fā)性肺上皮細胞癌和臨床分期為第III、IV期患者血清中MtCK的檢出率分別為71.3% 和65.4%，提示MtCK和CEA的聯(lián)合檢測可用于輔助檢測肺癌有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期具有重要意義。成繼民[10]等檢測50例肺癌患者血清中Mtck表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌陽性率為58%，P<0.05，其中肺腺癌陽性率87.5%，鱗癌陽性率為47.6%，未分化癌陽性率30%，腺鱗癌陽性率100%，推測MtCK血清學(xué)檢測可輔助肺癌的臨床診斷。張淇哲[11]等檢測MTCK在106例肺癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各病理分型肺癌組織中均可以檢測出MtCK陽性，且鱗癌細胞胞漿內(nèi)MtCK陽性染色最為明顯，揭示推測MtCK可能有助于肺癌及其分化程度的診斷。

1.2乳腺腫瘤Qian et al[12]對uMtCK在乳腺腫瘤組織中的表達進行了研究，結(jié)果表明uMtCK的表達與乳腺癌預(yù)后不良成正相關(guān)，并推測其可能作為乳腺腫瘤分子診斷標(biāo)志物。在體內(nèi)和體外的實驗研究表明，uMtCK過度表達可以通過穩(wěn)定線粒體跨膜電位，下調(diào)線粒體凋亡通路蛋白，抑制腫瘤細胞凋亡來促進乳腺腫瘤的生長。成繼民[13]等檢測45例乳腺腫瘤患者腫瘤組織中MtCK的表達，發(fā)現(xiàn)MtCK在各種乳腺腫瘤細胞中陽性表達率分別為：浸潤性乳腺導(dǎo)管癌78.2%、乳腺腺瘤10.0%、癌旁組織2.9%，推測MtCK輔助乳腺癌的臨床診斷具有重要意義。Cimino et al[14]通過對兩組乳腺癌患者基因表達譜的研究推測uMtCK可作為一個獨立的預(yù)后標(biāo)志物。

1.3肝癌Georget et al[15]研究肝移植患者肝組織病理中CK及其同工酶uMtCK表達及腺苷酸激酶表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝細胞肝癌患者腫瘤組織中有uMtCK表達，導(dǎo)致其CK表達水平顯著增高。Fadhil et al[16]對107例肝臟疾病患者血清（其中肝癌患者29例，酒精性肝硬化患者26例，原發(fā)性膽汁性肝硬化患者33例和肝功能衰竭患者19例）和34例正常人血清MtCK同功酶進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟疾病組患者血清CK活性水平均升高，分別為76.9%、60%、51%和63. 2%。Yoko et al[17]檢測147例原發(fā)性肝細胞癌合并肝硬化患者和92例活動性肝硬化患者血清中uMtCK表達，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝細胞癌合并肝硬化患者的血清中MtCK表達水平顯著高于活動性肝硬化患者MtCK表達水平（P <0.001），且原發(fā)性肝細胞癌合并肝硬化患者行射頻消融根治性治療后，患者血清中MtCK表達降至正常水平，且對于2厘米以下的小肝癌，患者血清中AFP及DCP檢測陰性的同時，MtCK診斷肝細胞癌的準(zhǔn)確率達到約60%，推測其可能成為肝癌早期診斷血清學(xué)分子標(biāo)志物。

1.4結(jié)直腸腺癌錢琤[18]等建立了人uMtCk基因表達含量的熒光定量檢測方法，并研究了30名結(jié)直腸腺癌病人腫瘤組織和癌旁組織uMtCk-mRNA的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺癌病人腫瘤組織中uMtCk-mRNA的含量升高，推測uMtCk mRNA含量的檢測有助于結(jié)直腸腺癌病人臨床診斷。Koven et al[19]檢測13例結(jié)腸癌患者血清，手術(shù)前有9例患者血清MtCK表達陽性，術(shù)后其表達變?yōu)殛幮裕?1例結(jié)腸癌或胃癌轉(zhuǎn)移的患者中有16例患者血清檢測MtCK陽性，認(rèn)為MtCK亦可作為胃腸道惡性腫瘤的血清學(xué)診斷標(biāo)志物。Mercer et al[20]比較直、結(jié)腸腫瘤病人血清中MtCK和CEA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MtCK檢測結(jié)、直腸腫瘤的敏感性高于CEA，56%vs.52%，P <0.05。顧鵬飛[21]等應(yīng)用蛋白電泳法檢測MtCK在行手術(shù)切除術(shù)的107例結(jié)直腸腺癌患者血清中的表達情況，同時檢測患者血清中癌胚抗原CEA及糖抗原CA242表達情況，并檢測非腫瘤患者血清中MtCK、CEA及CA242的表達情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺癌患者血清中MtCK、CEA及CA242的陽性率分別為59.8%、55.1%、63.5%，且MtCK檢測結(jié)直腸腫瘤的敏感性和特異性分別為59.8%、96.2%。推測血清MtCK檢測有助于結(jié)直腸腺癌的診斷，與CEA和CA242聯(lián)合檢測可輔助提高對結(jié)直腸腺癌診斷的特異性。

2　MtCK在腫瘤組織中過表達的機制

2.1 uMtCK與腫瘤細胞凋亡有研究認(rèn)為uMtCK的高表達可能是由于腫瘤細胞的代謝適應(yīng)表現(xiàn)[22]。uMtCK在腫瘤細胞中表達升高，使得腫瘤細胞可以在低氧和低糖的限制下仍然保持較快的生長速度，同時亦有助于維持一個較高的能量利用狀態(tài)，用以抵抗缺氧等壓力環(huán)境以及保護細胞免于調(diào)亡。uMtCK在腫瘤細胞中的高表達狀態(tài)是否僅是腫瘤細胞對能量需求的適應(yīng)性反應(yīng)呢？這種上調(diào)表達是否有促進腫瘤細胞生存和發(fā)展的意義呢？有研究指出，如果uMtCK能夠保護腫瘤細胞免于調(diào)亡，便能解釋為何過表達uMtCK的腫瘤往往侵襲性很強并且預(yù)后很差，因為對調(diào)亡的抵抗一直是腫瘤細胞對于化療和放療不敏感的首要原因[23]。研究者通過轉(zhuǎn)基因在小鼠肝臟中表達uMtCK后，再補充肌酸可以保護肝臟免受到缺血、缺氧和內(nèi)毒素的損害[24，25]。過表達uMtCK的肝臟中腫瘤壞死因子引起的調(diào)亡與壞死明顯減少[26]。同時，研究者們發(fā)現(xiàn)在海馬區(qū)的腦切片中uMtCK表達升高，在添加uMtCK的底物肌酸后，ATP水平和膜電位升高，這些可以有效保護海馬區(qū)腦細胞受到缺氧危害[27，28]。以上的研究支持過表達uMtCK可以使腫瘤細胞在某種程度上獲得一定的生長優(yōu)勢以抵抗調(diào)亡。

2.2 uMtCK與線粒體凋亡途徑國內(nèi)外許多研究表明，惡性腫瘤的形成是細胞增殖和細胞凋亡失衡的結(jié)果，細胞凋亡信號途徑的缺陷是惡性腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象，腫瘤細胞凋亡的抑制延長腫瘤細胞生存時間的同時促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，為腫瘤細胞的生長提供了條件。細胞凋亡是一種基因調(diào)控的細胞主動死亡過程，是多基因嚴(yán)格調(diào)控的過程，因此也被稱為程序性細胞死亡（Programmed cell death）[29,30]。細胞凋亡的兩條主要通路分別是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑（Death receptor-mediated pathway）和線粒體凋亡途徑或內(nèi)在途徑（Mitochondrial pathway），最終引發(fā)半胱氨酸蛋白酶（caspase）引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生[31,32]。uMtCK在細胞中的正常定位是在線粒體內(nèi)膜的外表面，與膜間隙蛋白如腺苷酸轉(zhuǎn)運體（Adenosine transporter，ANT）、電壓依賴性陰離子通道蛋白（Voltage dependent anion channel proteins，VDAC）等均存在相互作用，有研究認(rèn)為可能參與了線粒體膜通透轉(zhuǎn)運孔（Permeability transition pore，PTPC）的形成[33]。因而許多研究者認(rèn)為uMtCK很可能是通過控制PTPC來參與

調(diào)控線粒體介導(dǎo)的調(diào)亡[34]。

雖然細胞凋亡的兩條主要通路最終都要激活共同的凋亡效應(yīng)物，即特異的caspase，但兩條通路的上游事件(Up-stream activation)不同[35]。在脊椎動物細胞凋亡過程中，細胞色素C是在線粒體凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的分子。細胞損傷后，細胞色素C從線粒體釋放，并與細胞凋亡激活因子1（Apoptotic protease activating factor 1）結(jié)合，同時活化Caspase9前體，進而激活Caspase3，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細胞凋亡[36]。uMtCK屬于線粒體膜間間隙蛋白。Waterhouse et al[37]和Ly et al[38]研究表明，細胞色素C從線粒體中釋放依賴于線粒體膜通透性的增加和線粒體膜表面膜電位(ΔΨm)下降。Qian et al[12]研究表明，在穩(wěn)定高表達uMtCK的乳腺癌細胞株MDA-MD-231中，檢測到uMtCK可以穩(wěn)定線粒體的ΔΨm，同時可以抑制細胞色素C和有活性的caspase9的表達量，提示過表達的uMtCK可以通過穩(wěn)定ΔΨm，阻止細胞色素C釋放進胞質(zhì)，同時可以下調(diào)線粒體凋亡途徑蛋白來抑制腫瘤細胞的凋亡（圖1）。因此，推測uMtCK可能通過穩(wěn)定線粒體的ΔΨm，下調(diào)線粒體凋亡途徑蛋白來抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

2.3 uMtCK的泛素化Sanghoon Kwon et al[39]研究表明，在人胚腎細胞293（Human embryonic kidney，HEK293）中，uMtCK是錨蛋白重復(fù)序列-細胞因子信號抑制物盒蛋白家族9（Ankyrin repeat and SOCS box-containing 9，ASB9）新的靶位，并且ASB9可以招募泛素連接酶E3而使uMtCK泛素化并使其降解，這個泛素化作用依賴于ASB9上的細胞因子信號抑制物盒蛋白，在惡性腫瘤患者的血清中檢測到高表達的uMtCK其中一個原因可能就是ASB9的細胞因子信號抑制物盒蛋白區(qū)域發(fā)生突變，從而失去了泛素化uMtCK的能力而使其不能降解。關(guān)于uMtCK與其泛素化關(guān)系的研究報道不多，仍需大量研究證實。

2.4其他原因?qū)е翸tCK在腫瘤中過量表達的其他原因可能是由于：腫瘤細胞增殖、代謝速度加快，腫瘤組織增生迅速，迫使其需要機體供能增加，導(dǎo)致腫瘤細胞的MtCK的基因表達升高，腫瘤細胞內(nèi)此酶的含量增加；腫瘤細胞生長、增殖過快，腫瘤細胞增生和壞死加劇，MtCK漏入血液循環(huán)，導(dǎo)致患者血清中的MtCK表達活性升高；腫瘤患者接受化療同時，化療藥物對腫瘤細胞的破壞導(dǎo)致MtCK漏入血液中，血清中的MtCK活性升高。支持這一假設(shè)的依據(jù)是某些Cr類似物樣的抑制劑具有強烈的抑制腫瘤生長的作用[40]；其他核蛋白對uMtCK啟動子的調(diào)控。目前國外已有較多研究者將重點聚焦到基因和蛋白質(zhì)及MtCK的特定結(jié)構(gòu)等多個層次來探討病人血清中MtCK的形成機制[41,42]。

3　小結(jié)與展望

總之，國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)MtCK在多種惡性腫瘤患者血清中呈高表達，尤其對于某些早期腫瘤患者血清中呈高表達，并發(fā)現(xiàn)了MtCK與某些腫瘤病理分級、分期相關(guān)性。推測MtCK對于輔助腫瘤早期診斷、判斷腫瘤患者的預(yù)后、為臨床醫(yī)生選擇治療方案、觀察治療效果提供幫助具有極高的臨床價值。同時，相關(guān)分子生物學(xué)研究MtCK與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，推測過表達uMtCK可以使腫瘤細胞在某種程度上獲得一定的生長優(yōu)勢以抵抗調(diào)亡，亦可能通過穩(wěn)定線粒體的ΔΨm，下調(diào)線粒體凋亡途徑蛋白來抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。但MtCK在腫瘤組織中過表達的機制仍不明確，因此MtCK與腫瘤的相關(guān)性及在腫瘤治療中的意義值得進一步研究。

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（收稿：2015-02-02）

（本文編輯：張駿飛）

Serum mitochondrial creatine kinase levels in the diagnosis of patients with malignant tumor

Zhang Ningning，Lu Wei.

Liver Medical Institute，Second People’s Hospital，Tianjin 300192，China

【Abstract】Mitochondrial creatine kinase（MtCK）located in the space between inner membrance and outer membrance of intracellular mitochondria. Creatine kinase is a member of the creatine kinase isozyme. The mainly physiological function of MtCK is to provide the energy for muscle contraction through the creatine phosphate shuttle mechanism under aerobic condition，which plays an important role in mitochondrial respiratory control. Recently，over expression of ubiquitous MtCK（uMtCK）is found in malignant tumors with especially poor prognosis. The molecular biology mechanism of the over expression in malignant tumors is well studied and the scholars find that uMtCK might be useful in the diagnosis of malignant tumors. Meanwhile，molecular biology studies shows that over expression of uMtCK promotes malignant tumors growth though resisting apoptosis. We reviewed the role and molecular biologic mechanism of mitochondrial creatine kinase in the diagnosis of malignant tumor.

【Key words】Neoplasma；Mitochondrial creatine kinase；Clinical diagnosis

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.02.033

通訊作者：陸偉，E-mail: mail4luwei@163.com

*基金項目：天津市衛(wèi)生局科技基金面上項目（編號：2013KY01） ?
作者單位：300192天津市第二人民醫(yī)院天津市肝病醫(yī)學(xué)研究所
第一作者：張寧寧，女，33歲，博士研究生，主治醫(yī)師。主要從事肝腫瘤診療的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: mail4ningning@gmail.com