西安市第四醫(yī)院眼科(西安 710004)

白淑瑋 張國云

抑制P-糖蛋白表達逆轉視網(wǎng)膜母細胞瘤多藥耐藥研究*

西安市第四醫(yī)院眼科(西安 710004)

白淑瑋 張國云

目的：探討應用RNA干擾(RNAi)技術逆轉視網(wǎng)膜母細胞瘤多藥耐藥的可行性。方法：將設計合成的針對多藥耐藥基因MDR1的特異性小分子干擾RNA(siRNA)，用脂質體轉染具有MDR1基因高表達的視網(wǎng)膜母細胞瘤耐藥細胞株SO-Rb50/VCR。用實時定量RT-PCR技術和Westernblot分別測定轉染前后細胞MDR1mRNA及P-糖蛋白(P-gp)表達的變化；用CCK-8法和TUNEL法檢測轉染前細胞株(VCR組)，轉染后細胞(VCR+siRNA組)對不同濃度長春新堿、依托泊苷和卡鉑藥物敏感性。結果：VCR+siRNA組較VCR組比較，MDR1基因在mRNA水平和蛋白水平表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義。隨著長春新堿、依托泊苷濃度的升高VCR+siRNA組較VCR組比較，細胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義。不同濃度的卡鉑作用于VCR組、CT組和VCR+siRNA組細胞存活率、細胞凋亡率各組見未見顯著性差異。隨著長春新堿、依托泊苷濃度的升高，VCR+siRNA組較VCR組比較，細胞凋亡率顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學意義。結論：在SO-Rb50/VCR細胞中，針對MDR1合成的siRNA能夠有效地抑制MDR1mRNA和P-gp的表達，并能恢復腫瘤細胞對長春新堿和依托泊苷的敏感性。應用RNAi技術，能夠逆轉P-gp引起的視網(wǎng)膜母細胞瘤多藥耐藥性。

視網(wǎng)膜母細胞瘤(Retinoblastoma，RB)是兒童最常見的原發(fā)性眼內惡性腫瘤。Broaddus等調查顯示5歲以下兒童RB發(fā)病率高達11.8/百萬，占同齡兒童惡性腫瘤的6.1%[1]。在我國臺灣，RB的5年生存率為81%，其中雙眼RB 5年生存率僅64.3%[2]。在我們之前的流行病學研究中發(fā)現(xiàn)，我國RB診斷滯后，化學減容治療療效不佳，很多患者最終不得不接受眼球摘除術來控制腫瘤的發(fā)展[3]，這主要是由于部分RB表達多種耐藥相關蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(Multi-drug related protein，MRP)、肺耐藥蛋白(Lung resistance associated protein，LRP)等，因而對化療不敏感[4]，本文通過在視網(wǎng)膜母細胞耐藥細胞株中，抑制p-gp的表達來研究腫瘤細胞對長春新堿、卡鉑及依托泊苷的敏感性。

材料和方法

1 材 料 具有多藥耐藥性視網(wǎng)膜母細胞株SO-Rb50/VCR的建立，人視網(wǎng)膜母細胞瘤SO-Rb50為親本細胞，采用長春新堿濃度梯度法誘導多藥耐藥細胞SO-Rb50/VCR。采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液 ，在37 ℃、5%的CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，細胞呈懸浮生長，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2 方 法

2.1 RNA干擾試驗：針對MDR1 基因特異的siRNA 序列設計，由上海吉瑪公司完成。序列：(序列： 5 -GGAGGCCAACATACATGCCTT-3(VCR+siRNA組)，對照組siRNA(序列5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3(CT組)，應用Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(美國，Invitrogen )，實驗過程按照試劑說明書進行，SO-Rb50/VCR細胞轉染后在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育48h后進行后續(xù)實驗。

2.2 Realtime-PCR法檢測MDR1：mRNA的轉錄水平 SO-Rb50/VCR細胞(VCR組) 、VCR+siRNA組和CT組，按照Trizol RNA試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄反應獲得cDNA，然后進行Realtime-PCR，針對MDR1基因的引物序列5-CAGGATAGGTTTGATGGT-3，試劑 Power SYBR Green PCR Master mix (ABI公司)，應用 ABI7900HT定量PCR儀，PCR 循環(huán)設置：50℃2 min → 95℃10 min → (95℃15 sec → 60℃1 min) × 40個循環(huán)→95℃15sec → 60℃15sec→95℃15 sec(生成溶解曲線)，利用管家基因18s進行對目的基因的表達進行校正，得到相對定量結果。

2.3 Westernblot法檢測P-gp蛋白的表達：VCR組、VCR+siRNA組和CT組，提取細胞總蛋白，應用BCA 蛋白濃度測定試劑盒( 碧云天生物技術研究所)。每組取30μg 蛋白樣本，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移蛋白島硝酸纖維膜，應用封閉液進行封閉后，進行免疫雜交，加入稀釋的一抗兔抗人P-gp多克隆抗人(SantaCruz 公司)，4℃過夜，TBS液清洗( 碧云天生物技術研究所)，然后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(cell SantaCruz 公司)1h后，顯色，暗室下膠片，曝光，顯影定影，掃描輸入計算機。β-action為內參。

2.4 CCk-8試驗檢測細胞存活率：收集VCR組、VCR+siRNA組和CT組細胞，以每孔90μl約5×103個細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組3個孔，空白孔只加入100μl培養(yǎng)液，然后在實驗孔中分別加入長春新堿濃度梯度0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM，卡鉑濃度梯度為1μM、10μM、100μM、500μM，依托泊苷濃度梯度為1μM、50μM、100μM、150μM，培養(yǎng)箱孵育48h后，每孔加入10μl CCK-8 試劑，再孵育3h，然后用酶標儀測定450nm 波長的吸光度值(參比波長為620nm)。按照以下公式計算細胞存活率。細胞存活率(%)= [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As：實驗孔(VCR組/VCR+siRNA組/CT組+ 藥物+CCK-8 ；Ac：對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8)；Ab：空白孔(培養(yǎng)基、CCK-8)。實驗重復3次，取平均值。

2.5 細胞凋亡實驗：收集VCR組、VCR+siRNA組和CT組細胞1×108/ml，分別加入長春新堿濃度梯度0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM，卡鉑濃度梯度為1μM、10μM、100μM、500μM，依托泊苷濃度梯度為1μM、50μM、100μM、150μM，分別在培養(yǎng)箱孵育48h后，調整細胞濃度至于 1×107/ml，取100μl細胞懸液放入1.5ml離心管中，按照TUNEL檢測凋亡試劑盒進行實驗(Roche公司)。流式細胞儀進行檢測，檢測波長488nm檢測。

2.6 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，統(tǒng)計指標以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料采用獨立樣本t檢驗；P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 siRNA作用于SO-Rb50/VCR細胞后MDR1基因表達受到抑制 VCR+siRNA組較VCR組相比，MDR1 mRNA的表達水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1A)(P<0.05)；VCR+siRNA組較VCR組相比，P-gp蛋白表達水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1B)(P<0.05)。

2 不同濃度的長春新堿、卡鉑及依托泊苷分別作用于VCR組、CT組、VCR+siRNA組后細胞生存率的變化 不同濃度的長春新堿0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM，VCR組細胞生存率分別為0.88±0.07、0.80±0.08、0.78±0.05、0.75±0.09，VCR+siRNA組細胞生存率分別為0.78±0.10、0.62±0.07、0.48±0.11、0.22±0.09。CT組與VCR組相比各濃度組細胞存活率未見差異，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在長春新堿濃度為0.1μM、1μM，VCR+siRNA組較VCR組相比細胞生存率顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2A)。不同濃度的卡鉑，VCR組、CT組和VCR+siRNA組細胞存活率各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2B)。不同濃度的依托泊苷1μM、50μM、100μM、150μM，VCR組細胞存活率分別為0.88±0.06、0.83±0.12、0.75±0.11、0.64±0.10，VCR+siRNA組細胞生存率分別為0.86±0.05、0.81±0.07、0.55±0.09、0.21±0.06。CT組與VCR組相比各濃度組細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在依托泊苷濃度為100μM、150μM，VCR+siRNA組較VCR組相比細胞生存率顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2C)。

圖1 A：VCR+siRNA組MDR1基因mRNA表達水平在VCR+siRNA組顯著下降；B：VCR+siRNA組P-gp蛋白表達水平在VCR+siRNA組顯著下降

圖2 A：長春新堿濃度為0.1μM、1μM，VCR+siRNA組較VCR組相比，細胞生存率顯著性下降；B：不同濃度的卡鉑，VCR組、CT組和VCR+siRNA組細胞存活率各組見未見統(tǒng)計學差異；C：依托泊苷濃度為100μM、150μM，VCR+siRNA組較VCR組相比細胞生存率顯著下降；CT組與VCR組相比藥物各濃度組細胞存活率未見統(tǒng)計學差異

3 不同濃度的長春新堿、卡鉑及依托泊苷分別作用于VCR組和VCR+siRNA組后細胞凋亡的變化 見表3。

圖3 A：長春新堿濃度為0.1μM、1μM，VCR+siRNA組較VCR組相比細胞凋亡率顯著升高；B：不同濃度的卡鉑，VCR組、CT組和VCR+siRNA組細胞存活率各組見未見統(tǒng)計學差異；C：依托泊苷濃度為100μM、150μM，VCR+siRNA組較VCR組相比細胞凋亡率顯著升高；CT組與VCR組相比藥物各濃度組細胞存活率未見統(tǒng)計學差異

不同濃度的長春新堿0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM，VCR組細胞凋亡率分別為0.03±0.01、0.05±0.02、0.08±0.02、0.11±0.04，VCR+siRNA組細胞凋亡率分別為0.06±0.01、0.12±0.03、0.23±0.04、0.31±0.04。CT組與VCR組相比各濃度組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著長春新堿濃度的升高，VCR+siRNA組細胞凋亡率都高于VCR組細胞凋亡率，尤其在長春新堿濃度為0.1μM、1μM，VCR+siRNA組較VCR組細胞凋亡率顯著升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3A)。不同濃度的卡鉑，VCR組、CT組和VCR+siRNA組細胞凋亡率各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3B)。不同濃度的依托泊苷1μM、50μM、100μM、150μM，VCR組細胞凋亡率分別為0.03±0.00、0.07±0.02、0.11±0.02、0.17±0.01，VCR+siRNA組細胞凋亡率分別為0.04±0.01、0.08±0.02、0.21±0.02、0.29±0.03，CT組與VCR組相比各濃度組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在依托泊苷濃度為100μM、150μM，VCR+siRNA組較VCR組相比細胞凋亡率顯著升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3C)。

討 論

早在上世紀80年代就發(fā)現(xiàn)化學治療RB早期療效明顯，但在化療過程中多數(shù)患者會出現(xiàn)耐藥而導致治療失敗，化學減容治療的失敗是腫瘤對化療藥物耐藥所致。腫瘤多藥耐藥一直是腫瘤治療研究的熱點問題，大量研究指出通過抑制P-gp蛋白的表達可逆轉腫瘤耐藥[5-6]。在本研究中，通過RNAi抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤耐藥株中P-gp蛋白的表達，觀察腫瘤細胞對長春新堿、卡鉑及依托泊苷的敏感性。

本研究采用的視網(wǎng)膜母細胞瘤長春新堿耐藥細胞株(SO-RB50/VCR)，其高表達MDR1基因并具有多藥耐藥性[7]。SO-RB50/VCR細胞在轉染針對MDR1基因的siRNA后，MDR1基因mRNA表達水平顯著下降，p-gp蛋白表達水平顯著下降。而CT組作為陰性對照，無論是基因水平還是蛋白的表達水平均未見抑制作用，這說明siRNA能夠成功抑制SO-RB50/VCR細胞中MDR1基因的表達，并且具有一定的特異性。本研究結果還指出，CT組在對化療藥物的敏感性上，與VCR組未見明顯差異，這說明對照組siRNA和脂質體對腫瘤細胞的生長并沒有影響。而VCR+siRNA組較VCR組，在長春新堿和依托泊苷作用下，細胞生存率顯著下降，細胞凋亡顯著升高，這說明MDR1基因被成功抑制后，腫瘤細胞對化療藥物由轉染前的耐藥轉變?yōu)檗D染后的敏感。這提示著采用siRNA技術不僅能成功抑制掉MDR1基因的表達，在功能上還可以逆轉腫瘤細胞的耐藥性，這一研究結果也在很多腫瘤細胞系體外實驗中得到證實[5-6]。

長春新堿、卡鉑及依托泊苷是目前治療視網(wǎng)膜母細胞瘤的主要化療用藥。在我們的研究結果指出，在長春新堿濃度為0.1 μM 、1 μM，依托泊苷濃度為100μM、150μM時能明顯逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性。這提示著化療藥物有著其特定的作用濃度才能逆轉腫瘤耐藥，而體外實驗的藥物濃度應用于體內時還有很多亟需解決的問題，有待我們進一步探索。我們研究還得出，在SO-RB50/VCR細胞中P-gp被抑制后，無法逆轉腫瘤細胞對卡鉑的耐藥性。越來越多的研究也證實鉑類藥物耐藥與P-gp無關，可能存在其他的耐藥機制[8]。這也提示著腫瘤細胞的耐藥是多因素、多機制共同作用下的結果。

化學減容療法是RB重要的輔助治療方法之一，可提高RB的治愈率，改善RB患者的生存質量。腫瘤多藥耐藥是RB化療失敗的主要原因，因此克服化療耐藥是RB治療遠期療效的關鍵。采用RNAi作為一種基因治療的方法，體外實驗已經(jīng)廣泛應用于多種腫瘤細胞。本研究采用siRNA技術抑制SO-RB50/VCR中P-gp蛋白的表達，逆轉視網(wǎng)膜母細胞瘤耐藥，為RB的治療提供了新的前景。

[1] Kivela T. The epidemiological challenge of the most frequent eye cancer: Retinoblastoma，an issue of birth and death[J]. Br J Ophthalmol，2009，93(9):1129-1131.

[2] Chang CY，Chiou TJ，Hwang B，etal. Retinoblastoma in Taiwan: survival rate and prognostic factors[J]. Jpn J Ophthalmol，2006，50(3):242-249.

[3] Bai S，Ren R，Li B. Delay in the diagnosis of retinoblastoma in China[J]. Acta Ophthalmol，2011，89(1):e72-74.

[4] Li B，Gao R，Zhang H，etal. Studies on multidrug resistance associated protein in retinoblastoma[J]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2009，45(4):314-317.

[5] Callaghan R1，Luk F，Bebawy M. Inhibition of the multidrug resistance P-glycoprotein: Time for a change of strategy? [J]. Drug Metab Dispos，2014，42(4):623-31.

[6] Yhee JY，Song S，Lee SJ，etal. Cancer-targeted MDR-1 siRNA delivery using self-cross-linked glycol chitosan nanoparticles to overcome drug resistance[J].J Control Release，2015，28(198):1-9.

[7] Zhang H，Li B，Bai SW，etal. Constitutively active Akt contributes to vincristine resistance in human retinoblastoma cells[J]. Cancer Invest，2010，28(2):156-165.

[8] Yamagishi T，Sahni S. P-glycoprotein mediates drug resistance via a novel mechanism involving lysosomal sequestration[J].J Biol Chem，2013，288(44):31761-71.

(收稿：2015-05-27)

Inhibition of P-glycoprotein expression for reversing multidrug-resistance of retinoblastoma Department of Ophthalmology ，The Fourth Hospital of Xi，an City

( Xi’an 710004)

Bai Shuwei Zhang Guoyun

Objective : To investigate the effects of small interference RNA(siRNA) on the inhibition of MDR1 mRNA and reversal of drug resistance. Methods：The retinoblastoma (RB) multidrug resistant cells (SO-Rb50/VCR) were transfected with human MDR1 specific double-stranded，small interfering siRNA molecules. The expression of MDR1 mRNA was measured by realtime PCR and p-gp expression was detected by westernblot. Cell survival rate of SO-Rb50/VCR before(VCR group) and after transfection(VCR+siRNA group)was determined using a standard colorimetric cell counting kit-8 (CCK-8) to check the drug the sensitivity to three different chemotherapeutic. Rb cells apoptosis was analyzed by TUNEL assay. Result: The protein and mRNA expression level of MDR1 decreased significantly in the VCR+siRNA group compared to that in the VCR group.The percentage of cell survival decreased in VCR+siRNA group compared to that in the VCR group with the high dose of Vincristine or etoposide. The percentage of apoptotic cells to total cells was significantly higher in the siRNA+VCR group than that in the VCR group with the high dose of Vincristine or etoposide. There was no significant difference between groups when RB cells were treated by various dose of carboplatin. Conclusions:Inhibited the express of MDR1mRNA and p-gp by siRNA ，SO-Rb50/VCR cells were sensitive to vincristine and etoposide. RNAi can reverse the drug resistance to chemotherapeutic agents which were transferred by P-gp.

RNA interference Retinoblastoma Multidrug resistance-Associated proteines P-Glycoprotein Drug tolerance

*國家自然科學基金資助項目(81302198)

RNA干擾 視網(wǎng)膜母細胞瘤 多藥耐藥相關蛋白質類 P-糖蛋白 藥物耐受性

R364.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.002