西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科(西安710002)

劉佩勇 謝 梅 紀玉強# 趙 朝▲ 程曼麗

·論著·基礎研究·

長鏈非編碼RAN ENST00000447336在氧化型低密度脂蛋白誘導血管內(nèi)皮細胞損傷中的表達*

西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科(西安710002)

劉佩勇 謝 梅 紀玉強#趙 朝▲程曼麗

目的：檢測長鏈非編碼RAN (lncRNA) ENST00000447336在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中的表達水平。方法：采用實時定量RT-PCR法檢測ox-LDL誘導的損傷HUVEC與正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336表達水平。結果：ox-LDL誘導的損傷HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平(0.65±0.17)明顯高于正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平(0.29±0.11)，二者比較差異具有統(tǒng)計學意義。結論：損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平增高，lncRNA-ENST00000447336可能參與了血管內(nèi)皮細胞損傷過程。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，不編碼蛋白但可以調(diào)控基因的表達水平，參與了細胞增殖、分化、凋亡等生理過程，同時與多種疾病病理過程密切相關[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了心臟、血管的生長和分化，與動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、擴張性心肌病及強直性肌營養(yǎng)不良性心臟病等有關[4-9]。我們前期研究[10]利用Human lncRNA芯片比較氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作用后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)和正常HUVEC的lncRNA和mRNA表達水平，篩選出了HUVEC損傷相關的lncRNA，其中l(wèi)ncRNA ENST00000447336增高12倍，為進一步驗證芯片實驗結果，我們采用實時定量RT-PCR法檢測ox-LDL誘導的損傷HUVEC與正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336表達水平，為研究lncRNA參與血管內(nèi)皮細胞損傷的機制提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 細胞與材料 HUVEC-12內(nèi)皮細胞購自中國科學院上海研究所細胞庫，Trizol液(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，定量PCR試劑(大連寶生物工程有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)：取HUVEC細胞適量接種于含DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/ml)中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換半液，生長至融合狀態(tài)，倒置顯微鏡下觀察細胞呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，待細胞融合達 80%以上進行細胞傳代。當細胞融合達60%～70%時加入ox-LDL(終濃度100 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細胞。

2.2 細胞總RNA的提取：取1×106個細胞，完全吸去培養(yǎng)液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol液提取細胞總RNA，嚴格按照試劑說明書進行操作。使用Nanodrop-1000分光光度計測定RNA在260nm、280nm和230nm的吸收值，計算RNA濃度并評估純度，使用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。

2.3 cDNA合成：采用逆轉錄試劑盒進行cDNA合成，1.5 μg RNA、0.5μl 引物(10μM) 、 3.2μl dNTPs Mix(1.25mM)、加無RNA酶的H2O至總體積14.5 μl，混勻后在65℃水浴5min，冰上放置2 min。短暫離心后，在離心管中依次加入4 μl RT反應液5X First-Strand Buffer 、1μl 0.1 M DTT、0.3 μl RNase Ihibitor、0.2 μl SuperScript III RT混合后37℃恒溫1 min，50℃溫育60 min，70℃ 溫育15 min后-20℃保存。

2.4 實時定量PCR檢測lncRNA-ENST00000447336的表達：利用Primer 5.0軟件設計合成ENST00000447336及內(nèi)參GAPDH引物序列，ENST00000447336上游引物5'-TCACTTCCTCCATTTATGTTTCC-3'，下游引物5'-AACAATATGCAGCGACTGTGAAG-3'，產(chǎn)物長度79bp；GAPDH上游引物5'- GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物5'- GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'，產(chǎn)物長度299bp。10μl PCR反應體系包括：5 μl 2 × Master Mix、0.5μl 10μM 的PCR上游引物、0.5μl 10μM 的PCR下游引物及2μl cDNA，反應條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 60 s共35個循環(huán)。擴增結束后得到循環(huán)閾值即Ct值，每個樣本設置三個復孔?；虮磉_水平采用2-△△CT進行分析，ΔΔCt =實驗組ΔCt (目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)-對照組ΔCt(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct) 。

結 果

1 RNA樣本質量分析 細胞總RNA 的OD260/280比值在1.8～2.0之間，OD260/230比值大于1.8，所有樣本的 RNA 質量均滿足檢測要求，RNA電泳結果顯示電泳顯示5S、18S、28S條帶清晰，28S條帶的亮度大約是18 S的兩倍，證實從細胞提取的RNA完整性好，無降解，見附圖。

附圖 RNA樣本電泳

2 lncRNA-ENST00000447336在ox-LDL誘導的損傷HUVEC中的表達水平 實時定量PCR結果顯示ox-LDL誘導的損傷HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平為(0.65±0.17)，明顯高于正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平(0.29±0.11)，二者比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.355，P=0.001)。

討 論

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是動脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種，是多種心腦血管疾病的共同病理基礎，嚴重威脅著人們的健康。其發(fā)病機制尚未完全清楚，曾有多種學說從不同角度來闡述，包括脂質浸潤學說、血栓形成學說、平滑肌細胞克隆學說等。近年來多數(shù)學者支持“內(nèi)皮損傷反應學說”，認為各種主要危險因素最終損傷動脈內(nèi)膜，而粥樣硬化病變的形成是動脈對內(nèi)皮、內(nèi)膜損傷做出的驗證-纖維增生性反應的結果。血管內(nèi)皮細胞(Vascular endothelial cells，VEC)的損傷和功能障礙是AS發(fā)生和發(fā)展的始動因素和中心環(huán)節(jié)之一[11-12]。由于VEC損傷和功能障礙是啟動As事件，從保護VEC的形態(tài)及功能這一新的角度研究新型有效的抗AS的方法，對于AS疾病的防治具有良好的發(fā)展前景及臨床使用價值。

lncRNA是在小鼠全長cDNA文庫大規(guī)模測序時首次被提出來[13]，是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上(表觀遺傳調(diào)控、轉錄調(diào)控以及轉錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達水平，根據(jù)lncRNA與蛋白編碼基因的相對位置關系可分為正義型、反義型、內(nèi)含子型、雙向型及基因間型五種類型[14-15]。目前研究表明，lncRNA參與了調(diào)控機體的生長發(fā)育、細胞增殖、分化與凋亡等生理過程，與腫瘤、感染性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關[1-3]。近年來國內(nèi)外學者研究證實lncRNA也參與了心臟的發(fā)育及動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、擴張性心肌病及強直性肌營養(yǎng)不良性心臟病等過程。lncRNA-ANRIL(Antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL)即 INK4 基因座上的反義非編 RNA，位于染色體 9p21 區(qū)域 ；一項大規(guī)模的病例對照研究示 ANRIL 基因攜帶者較非攜帶者顯著增加心肌梗死的患病風險[16]。另外一項大規(guī)模病例-對照研究發(fā)現(xiàn)lncRNA- MIAT (Myocardial infarction-associated transcript，MIAT)基因的6個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點與心肌梗死密切相關[17]。Tie-1(表皮生長因子等位基因 1)的反義RNA 屬于長鏈非編碼 RNA，可以與Tie-1 mRNA結合，下調(diào)Tie-1的表達水平，而Tie-1是細胞表面酪氨酸激酶的一種受體，對胚胎發(fā)育中內(nèi)皮細胞的生長發(fā)育有重要意義。為了進一步研究lncRNA在動脈粥樣硬化中的作用，我們前期實驗[10]利用Human lncRNA Array芯片比較ox-LDL作用后的HUVEC和正常HUVEC的lncRNA和mRNA表達水平，篩選HUVE損傷相關的lncRNA。結果發(fā)現(xiàn)，相對于正常HUVEC，在ox-LDL 誘導損傷HUVEC表達上調(diào)和下調(diào)超過 2 倍的 lncRNA和mRNA有 139 種和113種，lncRNA上調(diào)和下調(diào)超過 4 倍的分別有 30 種和 8 種，mRNA上調(diào)和下調(diào)超過 4 倍的分別有 21 種和 7 種，其中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336增高12倍，但芯片實驗結果需要進一步驗證。我們采用實時定量RT-PCR技術檢測lncRNA-ENST00000447336在ox-LDL 誘導損傷HUVEC中的表達水平，結果顯示ox-LDL誘導的損傷HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平明顯高于正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平，這與芯片實驗結果基本一致。lncRNA-ENST00000447336來源于Ensembl數(shù)據(jù)庫，長度333個核苷酸，定位于Chromosome 7: 103，030，104-103，031，354，其在血管內(nèi)皮細胞損傷中的具體作用有待于進一步研究。

綜上所述，芯片實驗及實時定量PCR技術均證實lncRNA-ENST00000447336在示ox-LDL誘導的損傷HUVEC中高表達，可能與血管內(nèi)皮細胞損傷過程有關，隨著對lncRNA的研究深入將為為血管內(nèi)皮細胞損傷機制的研究提供新的實驗數(shù)據(jù)。

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(收稿：2015-06-30)

Expression of long noncoding RNA ENST00000447336 in oxidized low-density lipoprotein induced vascular endothelial cell Department of Cardiovascular Medicine，F(xiàn)irst Hospital of Xi’an

(Xi’an 710002)

Liu Peiyong Xie Mei Ji Yuqiang et al

Objective: To detect the expression long noncoding RNA (lncRNA)ENST00000447336 in oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) induced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) compared with normal HUVEC. Methods: The expression level of lncRNA-ENST00000447336 in ox-LDL induced HUVEC was detected by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Compared with normal HUVEC(0.29±0.11)，the expression level of lncRNA-ENST00000447336in ox-LDL treated HUVEC(0.65±0.17) was statistically higher. Conclusion: The expression level of lncRNA-ENST00000447336in ox-LDL induced HUVEC increased. lncRNA-ENST00000447336may be involved in the damage of HUVEC.

RNA,Long noncoding Endothelium,vascular Endothelial cells @Oxidized low-density lipoprotein

*國家自然科學基金資助項目(81470550)

RNA，長鏈非編碼 內(nèi)皮，血管 內(nèi)皮細胞 @氧化型低密度脂蛋白

R364.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.001

教育部科學技術研究重點項目(212170)

#西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

▲西安交通大學第一附屬醫(yī)院