陜西省蒲城縣醫(yī)院(蒲城 715500)

孔令武 潘軍強 王 毅 姚曉偉

阿托伐他汀鈣對動脈粥樣硬化兔主動脈TLR2表達的影響

陜西省蒲城縣醫(yī)院(蒲城 715500)

孔令武 潘軍強 王 毅 姚曉偉

目的：探討阿托伐他汀鈣對新西蘭大白兔主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR2表達的影響及其抗動脈粥樣硬化TLR機制。方法: 將新西蘭大白兔30只分為高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、高脂飲食組、正常對照組，喂養(yǎng)8周后處死每組動物取出主動脈，測量動脈粥樣硬化病變面積；行免疫組化染色及Western blot檢測，觀察兔主動脈粥樣硬化程度及TLR2蛋白在動脈粥樣硬化斑塊中的表達。結(jié)果:高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、高脂飲食組動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值及TLR2蛋白表達均高于正常對照組；高脂飲食加阿托伐他汀鈣組動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值及TLR2蛋白表達均低于高脂飲食組。結(jié)論:阿托伐他汀鈣可使主動脈粥樣斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達下調(diào)，具有顯著抗動脈粥樣硬化的作用。

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)常累積心、腦、腎等主要器官，致殘率及病死率高。脂質(zhì)代謝異常是動脈硬化最重要的危險因素，其發(fā)病機制成為心血領(lǐng)域研究的焦點。眾多研究認為AS是一種動脈血管的慢性、非特異性炎癥性病變。相關(guān)研究顯示：Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs) 是一組跨膜受體蛋白質(zhì)，TLR2是啟動炎性反應(yīng)的促炎因子，TLR2高水平在AS發(fā)生、發(fā)展中所起促進作用[1]。阿托伐他汀鈣作為一種經(jīng)典的調(diào)脂藥，除具有降低低密度脂蛋白膽固醇的作用外，還具有“多效性”如：改善血管內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化等功能[2]。本研究通過觀察阿托伐他汀鈣對兔主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達的影響，進而探討了其抗動脈粥樣硬化的機制。

材料與方法

1 實驗動物及藥品 購自西安交通大學(xué)實驗動物中心新西蘭兔30只，雄性，1月齡，體重1.2～1.5kg。在實驗室使用普通飼料喂養(yǎng)1周后，稱重，隨機分為三組：正常對照組、高脂飲食組及高脂飲食加阿托伐他汀鈣(國藥準(zhǔn)字H20051408)組，每組各10只。分別給予正常飼料120g/d、高膽固醇飼料120g/d、高膽固醇飼料120g/d+阿托伐他汀鈣10mg/(kg·d)灌胃，喂養(yǎng)8周后處死上述各組動物。

2 方 法

2.1 標(biāo)本取材及留?。焊鹘M實驗動物末次給藥前12 h禁食，在預(yù)定實驗終點3%戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈注射，全身麻醉后立即開胸取出從近主動脈弓部到髂動脈分叉處全部主動脈。所取組織分作兩段，一段以4%多聚甲醛液固定用于組織病理學(xué)檢測,另一段置于- 70℃冰箱用于提取蛋白。

2.2 免疫組化特異性染色鏡下觀察 ：疫組化法觀察新西蘭大白兔主動脈斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達水平。斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達的陽性結(jié)果為：血管壁染成棕黃色。用顯微鏡顯像系統(tǒng)采集圖像，隨機選取血管壁3個視野(×400)，計算機自動測量并計算A值。

2.3 Western blot檢測主動脈TLR2蛋白的表達：提取總蛋白并用BCA試劑盒測蛋白總濃度及變性。每孔以50g總蛋白上樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，加入一抗(1∶250鼠抗兔TLR2單克隆抗體或者1∶1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育過夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋)4℃孵育過夜。應(yīng)用凝膠掃描成像系統(tǒng)中進行掃描分析，以β-actin作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1 三組間 AS斑塊面積變化 見表1。高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、高脂飲食組AS斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高脂飲食加阿托伐他汀鈣組AS斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值低于高脂飲食組，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 組斑塊面積百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高脂飲食組比較，#P<0.05

2 三組間TLR2蛋白特異性染色表達陽性面積比比較 見表2、圖1。高脂飲食加阿伐他汀鈣組、高脂飲食組血管壁TLR2蛋白表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高脂飲食加阿托伐他汀鈣組血管壁TLR2蛋白表達高于高脂飲食組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組主動脈血管壁TLR2蛋白表達半定量分析

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高脂飲食組比較，#P<0.05

圖1 各組主動脈血管壁TLR2蛋白表達(×400)

3 三組間TLR2蛋白Western blot結(jié)果比較 見圖2。高脂飲食組、 高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、對照組TLR2蛋白表達分別為1.415±0./066、0.913±0.087、0.412±0.038。組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 TLR2蛋白Western blot結(jié)果

討 論

研究顯示患有動脈粥樣硬化癥的患者，均處于慢性、亞臨床的炎性狀態(tài)[3-4]，TLR2是啟動慢性炎性反應(yīng)的促進因子。本研究通過高脂飲食及高脂飲食加阿托伐他汀鈣建立動脈粥樣硬化兔模型，應(yīng)用免疫組化法和Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，各動脈粥樣硬化組主動脈組織中TLR2蛋白表達明顯上調(diào)，提示在動脈粥樣硬化的發(fā)生、進展過程中，TLR2可能起著重要作用。

有研究報道TLR2促進脂肪在巨噬細胞中積聚，最終導(dǎo)致巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，后者是動脈粥樣硬化的標(biāo)志[5]。TLR2在糖尿病鼠中高表達，易發(fā)生高脂飲食誘發(fā)的胰島素抵抗；相反，用高脂飲食喂養(yǎng)老鼠，抑制TLR2功能后，胰島素敏感性增加，促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用減弱[6-7]。此外，TLR2可通過多種可溶性細胞因子產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)：活化補體及內(nèi)皮細胞、增加血管通透性、聚集中性粒細胞。聚集的中性粒細胞則可進一步釋放炎癥因子、蛋白酶、活性氧等物質(zhì)直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮損害。內(nèi)皮細胞受損后又可產(chǎn)生黏附因子，后者進一步招募中性粒細胞，周而復(fù)始，形成惡性循環(huán)?？傊?，眾多研究都支持TLR2水平高表達促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

本研究顯示，正常新西蘭大白兔給予高膽固醇飼料飼養(yǎng)后，可出現(xiàn)明顯的主動脈硬化，亦有大量動脈粥樣硬化斑塊形成。應(yīng)用免疫組化與Western-blot技術(shù)，從組織學(xué)與細胞學(xué)水平、分子信息水平通過半定量與定量的分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)高脂飲食可使主動脈血管壁TLR2蛋白表達明顯上調(diào)，給予他汀類調(diào)脂藥阿托伐他汀鈣干預(yù)后TLR2蛋白表達可下調(diào)。即阿托伐他汀鈣在一定程度上使主動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達下調(diào)。這進一步從分子生物信息學(xué)的角度證明TLR2參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，而阿托伐他汀鈣通過下調(diào)TLR2蛋白表達發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。有關(guān)阿托伐他汀鈣通過下調(diào)TLR2蛋白表達，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用的精確分子機制有待于進一步研究。

[1] Caricilli AM, Nascimento PH, Pauli JR,etal. Inhibition of toll-like receptor 2 expression improves insulin sensitivity and singnaling in muscle and white adipose tissue of mice fed a high-fat diet[J].Journal of Endocrinology, 2008,199(3):399-406.

[2] Gocmen AY, Ocak GA, Ozbilim G,etal. Effect of atorvastatin on atherosclerotic plaque formation and platelet activation in hypercholesterolemic rats[J]. Can J Pharmacol, 2013,91(9):680-685.

[3] 李永紅, 葛志明, 王其新, 等．阿托伐他汀對高膽固醇血癥患者血小板血管緊張素Ⅱ受體表達的影響[J]．中華高血壓雜志，2008, 16(10):894-898．

[4] Maiti R, Agrawal NK．Atherosclerosis in diadbetes mellitus: role of inflammation[J].Indian Journal of Medical sciences,2007,61(5): 292-306.

[5] 姚曉偉,潘軍強,陳海潮,等. 吡咯列酮對兔主動脈粥樣硬化程度的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013，42(9):1118-1120.

[6] Dasu MR, DevardjS, Park S,etal. Increased toll-like receptor (TLR) activation and TLR ligands in rescently diagnosed type 2 diabetic subjects[J]. Diabetes Care, 2010,33(4):861-868.

[7] Zhang F． Peroxisome proliferator-activated receptor-γ as a therapeutic target for hepatic fibrosis: from bench to bedside[J]． Cell Mol Life Sci,2013,70(6): 259-276．

(收稿：2015-08-03)

@阿托伐他汀鈣 動脈粥樣硬化/病理生理學(xué) 膽固醇/分析 Tou樣受體 兔

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.005