陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科(西安710061)

袁 淵 姚安梅 周 敏 王 靜

·臨床研究·

miR-300在漿液性卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科(西安710061)

袁 淵 姚安梅 周 敏 王 靜

目的:探討miR-300在漿液性卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義。方法:收集卵巢癌患者、良性卵巢腫瘤患者及健康婦女各57例的血清標本，提取血清總RNA，通過實時定量PCR檢測血清miR-300的表達水平，并繪制ROC曲線；采用χ2檢驗miR-300的表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系，Kaplan-Meier法分析患者5年總體生存率之間的關(guān)系。結(jié)果: 卵巢癌患者血清中miR-300的表達水平顯著高于良性卵巢腫瘤患者及健康對照患者，miR-300 ROC曲線下面積0.812 (95%CI:0.761-0.911)，靈敏度為84.6%，特異度為85.3%。血清miR-300的表達水平與漿液性卵巢癌患者的臨床分期密切相關(guān)(P=0.0018)，而與年齡(P=0.792)及淋巴結(jié)分期(P=0.793)無顯著相關(guān)性。血清miR-300高表達的卵巢癌患者5年總體生存率要顯著低于血清miR-300低表達患者。結(jié)論: 漿液性卵巢癌患者血清中miR-300表達水平增高，為漿液性卵巢癌的臨床診斷及預(yù)后判斷提供了重要參考。

卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤，在女性常見惡性腫瘤中占2.4%～6.5%，在女性生殖系統(tǒng)癌中次于宮頸癌和宮體癌。卵巢癌的病因尚不清楚，可能與年齡、生育、血型、精神因素及環(huán)境等有關(guān)，此外，卵巢癌發(fā)病隱匿，早期可無癥狀，晚期常有腹脹、腹大或下腹部包塊、或包塊長大迅速，發(fā)現(xiàn)時患者常處于晚期已失去手術(shù)機會，往往病程短，病死率高，嚴重威脅著婦女的健康和生命[1]。因此，提高卵巢癌的早期診斷率，給予合理的早期治療，對于提高患者生存質(zhì)量、降低患者病死率有重要的臨床意義。

MicroRNA (miRNA)是一類進化上保守的非編碼小分子RNA，具有在翻譯水平調(diào)控基因表達的功能。研究表明miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。此外，新的研究結(jié)果顯示miRNA在血清中穩(wěn)定表達,腫瘤患者血清中的miRNA可以作為腫瘤診斷的標志物[2-3]。本研究我們將檢測漿液性卵巢癌患者血清中miR-300的表達情況并分析其診斷及判斷預(yù)后的價值。

材料與方法

1 材 料 收集2007年6月至2010年6月期間陜西省腫瘤醫(yī)院收治的57例漿液性卵巢癌患者、57例良性卵巢腫瘤患者、57例健康體檢者的血清標本，受試者的臨床資料完整，并自愿簽訂了知情同意書。病例納入標準:①患者均經(jīng)影像學(xué)和病理組織學(xué)確診為漿液性卵巢癌，均為初診初治患者；②均未接受放、化療及激素等藥物治療；③肝腎功能未見異常；④無其他腫瘤及內(nèi)科疾病。術(shù)后每3個月進行一次隨訪，隨訪截止之間為2015年6月。實驗組漿液性卵巢癌患者年齡28～70歲，其中I-II期23例，III-IV期34例，高分化27例，中/低分化30例；健康對照組年齡27～75歲；良性卵巢腫瘤患者組年齡25～74歲。三組受試者在年齡、生理等一般資料方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性?？崭共裳?ml，真空干燥管中保存，2000r/min，10min 后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 miR-300的提取及反轉(zhuǎn)錄 按照北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟提取miRNA。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。應(yīng)用TaKaRa公司的特異性miRNA反轉(zhuǎn)錄引物并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，每個反轉(zhuǎn)錄體系中含有10 ng 的RNA模板。反轉(zhuǎn)錄的條件: 15℃ 20 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。

3 RT-qPCR 反應(yīng)條件：95℃ 10s，95℃20 s，62℃ 40s，40個循環(huán)。采用的相對定量法計算miR-300的相對表達量(F)，F(xiàn) = 2-△ct，△ct =ctmiR-300-ctU6，其中ct為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4 血清CA125含量檢測 使用全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的AXSYM生化分析儀及配套CA125檢測試劑對血清 CA125 進行檢測，參考值為0～35 U/ml。

結(jié) 果

1 miR-300在漿液性卵巢癌患者血清、良性卵巢腫瘤患者血清、和健康對照血清中的表達水平差異 通過RT-qPCR檢測漿液性卵巢癌患者血清、良性卵巢腫瘤患者血清、和健康對照血清中miR-300 的表達水平，結(jié)果顯示漿液性卵巢癌患者血清中miR-300的表達水平顯著高于良性卵巢腫瘤患者及健康對照患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(漿液性卵巢癌組vs良性卵巢腫瘤組：P<0.001；漿液性卵巢癌組vs健康對照組：P<0.001)，而在良性卵巢腫瘤患者與健康對照組血清中miR-300的表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(良性卵巢腫瘤組vs健康對照組：P=0.069)，如圖1。

圖1 漿液性卵巢癌患者、良性卵巢腫瘤患者及健康對照血清中miR-300的表達水平

2 血清miR-300表達水平與漿液性卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 將57例漿液性卵巢癌患者按照病例特征因素(年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、細胞核分化程度)進行分類，進一步分析血清miR-300相對表達量與漿液性卵巢癌患者臨床特征的關(guān)系。卡方分析結(jié)果顯示，血清miR-300的表達水平與漿液性卵巢癌患者的臨床分期密切相關(guān)，隨著漿液性卵巢癌患者臨床分期的進展，血清miR-300的表達亦逐漸升高，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0018)。此外，血清miR-300在漿液性卵巢癌細胞核中/低分化組的表達顯著高于細胞核高分化組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。血清miR-300的表達與漿液性卵巢癌其他臨床病理特征，包括年齡、淋巴結(jié)分期均無顯著相關(guān)性，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(年齡>60 歲vs年齡<60歲：P=0.792；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組vs淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組：P=0.793)，見附表。

3 血清miR-300表達水平在漿液性卵巢癌中的診斷效率 根據(jù)上述血清miR-300的表達水平，建立miR-300和CA125的ROC曲線，利用ROC曲線評價兩者在卵巢癌中的診斷價值。結(jié)果顯示，miR-300 ROC曲線下面積0.812 (95%CI:0.761-0.911)，靈敏度為84.6%，特異度為85.3%； CA125ROC曲線下面積為0.849 (95%CI:0.764-0.927)，靈敏度為92.9%，特異度為84.2%，如圖2。血清miR-300和CA125均具有較好的診斷價值。

附表 血清miR-300表達與患者臨床病理特征關(guān)系

圖2 血清miR-300及CA125診斷卵巢癌ROC曲線

4 血清miR-300表達與漿液性卵巢癌患者生存之間的關(guān)系 生存分析結(jié)果顯示，血清miR-300表達與漿液性卵巢癌患者術(shù)后5年總體生存率密切相關(guān)，血清miR-300高表達的漿液性卵巢癌患者術(shù)后5年總體生存率顯著低于血清miR-300低表達的漿液性卵巢癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0114)，如圖3。

圖3 血清miR-300表達與患者術(shù)后5年總體生存率關(guān)系

討 論

miRNA是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體，經(jīng)過Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子(18～25個核苷酸)，通過與靶基因的種子區(qū)序列相互配對抑制其基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯行使其功能，廣泛存于真核生物體中[4]。近年來，大量研究表明，miRNA調(diào)控機體多種生理和病理過程，參與細胞的增殖、凋亡、分化、代謝等生物進程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)mi RNA 在多種腫瘤組織中均有特異性的表達譜[6-7]，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的各個階段，且每一個階段都有相應(yīng)的基因發(fā)生改變，同時也有調(diào)控這些基因的miRNA發(fā)生變化[8]。有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血液中的RNA包被于一種含有外泌體、凋亡小體、微泡、凋亡微粒體的微粒中，以此可以逃避RNA酶的降解，穩(wěn)定存在于循環(huán)血液中[9]。近年來，血清中游離miRNA的早期診斷價值在肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等常見腫瘤中得到了良好的驗證[10-12]。因此，血清中游離miRNA被認為是有價值的腫瘤檢測指標之一，能夠穩(wěn)定地被檢測并且提示腫瘤狀態(tài)，使miRNA成為新的腫瘤標志物具有良好的應(yīng)用前景[13]。

miR-300是長度為22個核苷酸的非編碼RNA分子，研究顯示miR-300與多種腫瘤密切相關(guān)。Xu XH等人研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中miR-300通過靶向作用于P53促進乳腺癌的增殖[14]。在骨腫瘤中miR-300表達上調(diào)，并且靶向作用于BRD7分子促進細胞的增殖及侵襲[15]。我們通過檢測漿液性卵巢癌患者血清中miR-300的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-300可作為漿液性卵巢癌治療及預(yù)后的分子指標。

[1] Ibrahim FF, Jamal R, Syafruddin SE,etal. MicroRNA-200c and microRNA-31 regulate proliferation, colony formation, migration and invasion in serous ovarian cancer [J].J Ovarian Res, 2015, 8:56.

[2] Orozco AF, Lewis DE. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma [J].Cytometry A, 2010, 77(6):502-514.

[3] Mitchell P S,Parkin R K, Kroh E M,etal. Circulating micro RNAs as stable blood-based markers for cancer detection [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105: 10513 -10518.

[4] Jiang C, Chen X, Alattar M,etal. MicroRNAs in tumorigenesis, metastasis, diagnosis and prognosis of gastric cancer [J]. Cancer Gene Ther, 2015, 22(6):291-301.

[5] Lin S, Gregory RI. MicroRNA biogenesis pathways in cancer [J].Nat Rev Cancer, 2015, 15(6):321-333.

[6] Calin CA,Croce CM.Micro RNA signatures in human cancers [J]. Nat Rev Cancer, 2006, 6:857-866.

[7] Lu J, Gerz G, Miska EA,etal.Micro RNA expression profiles classify human cancer [J]. Nature, 2005, 435:834-838.

[8] Sotiopoulou G, Pampalakis G, Lianidou E,etal. Emerging of micro RNAs as molecular switches in the integrated circuit of the cancer cell[J]. RNA, 2009, 15(8):1443-1461.

[9] Orozco AF, Lewis DE. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma [J].Cytometry A, 2010, 77(6):502-514.

[10] Xi Chen, Yi Ba, Lijia Ma,etal.Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases [J]. Cell Research, 2008, 18:997-1006.

[11] Sota Asaga, Christine Kuo, Tung Nguyen,etal. Direct serum assay for microrna-21 concentrations in early and advanced breast cancer [J]. Clinical Chemistry, 2011, 57(1): 84-91.

[12] Tsujiura M, Ichikawa D, Komatsu S,etal. Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers [J].Br J Cancer, 2010, 102(7):1174-1179.

[13] 劉寶瑞,謝 麗.miRNA:新一代腫瘤生物標志[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2010, 15(1):1-5.

[14] Shen Z, Li C, Zhang K,etal. The up-regulation of miR-300 in gastric cancer and its effects on cells malignancy [J].Int J Clin Exp Med, 2015, 8(5):6773-83.

[15] Xue Z, Zhao J, Niu L,etal. Up-Regulation of MiR-300 promotes proliferation and invasion of osteosarcoma by targeting BRD7 [J].PLoS One, 2015, 10(5):e0127682.

(收稿：2015-07-18)

Expression and clinical significance of serum miR-300 in serous ovarian cancer patients Department of Gynecological Oncology，Shaanxi Provincial Tumor Hospital

(Xi’an 710061)

Yuan Yuan Yao Anmei Zhou Min et al

Objective:To investigate the expression and clinical significance of serum miR-300 in serous ovarian cancer patients．Methods: Collected serum samples of 57 newly diagnosed serous ovarian cancer patients，57 benign ovarian tumor patients，and 57 healthy women. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the expression of serum miR-300. Diagnostic value of serum miR-300 in serous ovarian cancer was analyzed by the receiver operating characteristic (ROC) curve. Meanwhile，the relationships between serum miR-300 expression and clinicopathological features serous ovarian cancer was analyzed by χ2 test. The association of serum miR-300 expression and 5-years overall survival of serous ovarian cancer was analyzed by Kaplan-Meier method．Results: The expression of serum miR-300 of serous ovarian cancer patients showed statistically higher than controls. The area under the ROC curve (AUC) was 0.812 (95%CI:0.761-0.911)．miR-300 screening ovarian cancer sensitivity rate was 84.6%，specificity rate was 85.3%. The serum miR-300 expression was significantly correlated with clinical stage (P=0.0018), but had no significant correlation with age(P=0.792) and lymph node staging (P=0.793). 5-year overall survival rate of patients with high serum miR-300 expression was significantly lower than patients with low serum miR-300 expression. Conclusion: The relative expression level of serum miR-300 was significantly increased in patients with ovarian cancer，which indicated serum miR-300 was a promising diagnostic and prognostic biomarker in serous ovarian cancer.

@miR-300 Ovarian neoplasms/pathology Prognosis Diagnosis

@miR-300 漿液性卵巢腫瘤/病理學(xué) 預(yù)后 診斷

R737.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.008