劉國(guó)雄，婁 楠，王 洋，吳元成，黃嵐峰

（1.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳518109；2.深圳市人民醫(yī)院；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院）

骨肉瘤為青少年最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，惡性程度高，進(jìn)展快，預(yù)后差，增加了臨床治療的難度。對(duì)骨肉瘤化療藥物的研究，近年來(lái)取得了一定的進(jìn)展［1－2］，但仍有相當(dāng)數(shù)量的患者對(duì)藥物不夠敏感或用后很快產(chǎn)生耐藥性，預(yù)后不佳，而與此同時(shí)，現(xiàn)今所用的骨肉瘤相關(guān)藥物均有很強(qiáng)的副作用，這就使大劑量的藥物治療變得難以接受。于是目前迫切需要尋求療效更好的、副作用又小的化學(xué)治療藥物。長(zhǎng)春新堿在應(yīng)用于一些惡性腫瘤的治療，如白血病等，均取得了很好的療效［3］，但在長(zhǎng)期應(yīng)用于骨肉瘤這類惡性腫瘤方面，還鮮見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)道。本文應(yīng)用骨肉瘤MG63細(xì)胞作為體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，較為系統(tǒng)地研究了長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞抑制增殖及促凋亡的效應(yīng)；分析了長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞內(nèi)caspase 9及c－myc基因表達(dá)的影響，闡明其作用的分子機(jī)理，為指導(dǎo)治療骨肉瘤這類惡性腫瘤的臨床治療，提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 MG63細(xì)胞來(lái)源于ATCC。Hoechest 33342及CCK－8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒源自碧云天生物技術(shù)研究所，Total RNA提取試劑源自Invitrogen公司，RNase free DNase I源自Promega，RT試劑盒源自TaKaRa，PCR引物由TaKa－Ra合成，實(shí)時(shí)PCR試劑（Sybe－Green）購(gòu)自ABI公司，長(zhǎng)春新堿源自哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和長(zhǎng)春新堿處理 細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的H－DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、飽和濕度、37℃條件下于恒溫孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將處于指數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，而后分別加入配制好的不同濃度的長(zhǎng)春新堿（0、5、10、20、50、100μg·L－1），繼續(xù)培養(yǎng)24h后，開(kāi)始收集細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后接種96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μl細(xì)胞懸液（1×103個(gè)細(xì)胞／孔），按照實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行標(biāo)記，每組設(shè)6個(gè)平行孔。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，24h取出96孔板，在待測(cè)孔中加入10μl的CCK－8試劑，37℃孵育2h，測(cè)定490nm處吸光度，依據(jù)結(jié)果并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 收集細(xì)胞于EP管中，用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次，將2mol·L－1的Hoechest33342分別加入經(jīng)不同濃度長(zhǎng)春新堿處理過(guò)的細(xì)胞，于37℃孵育30min，再用PBS緩沖液清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Realtime RT－PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平 應(yīng)用Trizol Reagent提取不同濃度長(zhǎng)春新堿處理過(guò)的細(xì)胞總RNA，用RNase free DNase I處理相應(yīng)的RNA，并用RT試劑盒將相應(yīng)的RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，以上操作均參考相關(guān)商品說(shuō)明書(shū)。PCR引物序列：內(nèi)參 RPL－13上游引物，5’－CGA GTT GGC TGG AAG TAC C－3’；下游引物，CTT CTG GCC TGT TTC CGT AG－3’。caspase9上游引物，5’－GCG ACC TGA CTG CCA AGA AA－3’；下游引物，5’－TCA CAA TCT TCT CGA CCG TTA CA－3’。c－myc上游引物，5’－ACA ACC GAA AAT GCA CCA GC－3’；下游引物，5’－GTC GTT TCC GCA ACA AGT CC－3’。應(yīng)用Sybe－Green反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)體積為25μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min；95℃、15s，60 ℃、30s，95℃、15s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性均經(jīng)其融解曲線證實(shí)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的各濃度實(shí)驗(yàn)組的Ct值，與各濃度內(nèi)參RPL－13的Ct值進(jìn)行比較，兩者的差值即為該實(shí)驗(yàn)組的△Ct值，即實(shí)驗(yàn)組△Ct值＝實(shí)驗(yàn)加藥組Ct值－內(nèi)參加藥組Ct值。同理對(duì)照組△Ct值＝實(shí)驗(yàn)對(duì)照組Ct值－內(nèi)參對(duì)照組Ct值。通過(guò)實(shí)驗(yàn)組△Ct值與對(duì)照組△Ct值的比較，得出實(shí)驗(yàn)組各濃度的△△Ct值＝實(shí)驗(yàn)組△Ct值－對(duì)照組△Ct值。最后通過(guò)2（－△△Ct）來(lái)定量基因表達(dá)的改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)春新堿減低MG63細(xì)胞的增殖率 長(zhǎng)春新堿濃度為1、2、5、10、20、50和100μg·L－1作用于MG63細(xì)胞24h后對(duì)細(xì)胞的影響。其中長(zhǎng)春新堿濃度為10μg·L－1時(shí)即可顯著抑制MG63的細(xì)胞增殖（P＜0.05），呈明確的劑量－效應(yīng)關(guān)系，即抑制作用隨著藥物劑量的增加更明顯。

圖1 長(zhǎng)春新堿減低MG63細(xì)胞的增殖率

2.2 長(zhǎng)春新堿促進(jìn)MG63的細(xì)胞凋亡 為反映長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞凋亡的作用，我們用Hoechest33342染色不同濃度處理過(guò)的MG63細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞核呈均勻的淡藍(lán)色，存活細(xì)胞占絕大多數(shù)，而凋亡細(xì)胞數(shù)量極少；在長(zhǎng)春新堿作用下，出現(xiàn)一些散在分布的致密濃染物質(zhì)，這些物質(zhì)顏色發(fā)亮而體積較小，此為蓄積大量Hoechest染料的已經(jīng)出現(xiàn)凋亡核濃縮現(xiàn)象的MG63細(xì)胞（如圖2所示）。

2.3 長(zhǎng)春新堿作用影響相關(guān)基因的表達(dá) 經(jīng)過(guò)10和50μg·L－1長(zhǎng)春新堿處理后，細(xì)胞內(nèi)c－myc的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），分別減低為對(duì)照組的（48.11±15.12）%和（35.84±5.97）%，呈明顯的濃度依賴關(guān)系；caspase9mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為對(duì)照組的3.46±1.24倍和16.85±2.02倍，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。表明長(zhǎng)春新堿是通過(guò)下調(diào)c－myc基因表達(dá)，上調(diào)caspase9基因表達(dá)抑制MG63細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的。

圖2 長(zhǎng)春新堿作用后凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變（×100）

圖3 長(zhǎng)春新堿顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)c－myc及顯著上調(diào)caspase9的mRNA表達(dá)水平

3 討論

長(zhǎng)春新堿是作用于細(xì)胞周期的一種特異性藥物。通常在細(xì)胞周期的S期，同微管蛋白進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而干擾了紡錘體的生成，阻斷了細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。長(zhǎng)春新堿在其它方面也有顯著的作用，例如它還可以影響細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)代謝功能，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［5－9］。

本研究深入討論了長(zhǎng)春新堿作用于骨肉瘤MG63細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生的一系列抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用，及其相關(guān)的分子機(jī)理。結(jié)果證實(shí)低劑量（10μg·L－1）的長(zhǎng)春新堿即可顯著抑制該細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。該劑量遠(yuǎn)低于長(zhǎng)春新堿可以引發(fā)的機(jī)體中毒劑量（2mg·kg－1），這也就提示我們，長(zhǎng)春新堿作為治療骨肉瘤這一類惡性腫瘤的新型化療藥物，具有廣闊研究和應(yīng)用的價(jià)值。有研究［10－11］顯示：長(zhǎng)春新堿當(dāng)與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可增加MG63細(xì)胞對(duì)其他化療藥物的敏感性等，這些研究結(jié)果都可以支持本研究得出的結(jié)論。目前臨床治療骨肉瘤常用的化療藥物有單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、順鉑（CDP）、異環(huán)磷酰胺（IFO）等一些藥物。但也有相關(guān)研究［12－13］顯示，這些藥物長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用對(duì)于心臟、肝、腎等重要器官有較強(qiáng)的毒副作用，并且應(yīng)用這些藥物化療后多會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥的病例。

細(xì)胞增殖是指細(xì)胞以分裂的方式產(chǎn)生新的個(gè)體或新的細(xì)胞，用來(lái)對(duì)抗衰老和死亡細(xì)胞的過(guò)程。機(jī)體細(xì)胞的正常增殖是按照需要被嚴(yán)格調(diào)控的。一旦細(xì)胞增殖失去調(diào)控則會(huì)引起相應(yīng)的腫瘤發(fā)生。細(xì)胞增殖受到各種分子信號(hào)調(diào)控，其中c－myc是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖的基因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［13－15］。本研究結(jié)果顯示：濃度為10μg·L－1長(zhǎng)春新堿作用下就可以顯著抑制MG63的細(xì)胞增殖（P＜0.05），并且呈明確的劑量－效應(yīng)關(guān)系，即抑制作用隨著藥物劑量的增加更明顯；且在10和50μg·L－1長(zhǎng)春新堿作用下，MG63細(xì)胞內(nèi)c－myc mRNA表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），分別為對(duì)照組的（48.11±15.12）%和（35.84±5.97）%，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。表明：長(zhǎng)春新堿可以有效下調(diào)MG63細(xì)胞內(nèi)c－myc mRNA表達(dá)量，是其致細(xì)胞抑制的主要原因。而c－myc可以導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生，長(zhǎng)春新堿可顯著下調(diào)其mRNA表達(dá)水平，提示長(zhǎng)春新堿的抗腫瘤機(jī)制之一是通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)c－myc的表達(dá)的途徑來(lái)完成的。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體為調(diào)控自身的生長(zhǎng)發(fā)育，維護(hù)其內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，由自身基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡可以發(fā)生細(xì)胞核的濃縮、染色體DNA被以核小體為單位而片段化，核固縮，以致最終形成凋亡小體，但并不釋放溶酶體，引起周圍細(xì)胞發(fā)生溶解。Caspase9在促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到了重要作用［16］。本研究的結(jié)果還顯示：在長(zhǎng)春新堿作用下，出現(xiàn)一些散在分布的致密濃染物質(zhì)，這些物質(zhì)顏色發(fā)亮而體積較小，此為蓄積大量Hoechest染料的已經(jīng)出現(xiàn)凋亡核濃縮現(xiàn)象的MG63細(xì)胞；caspase9mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為對(duì)照組的3.46±1.24倍和16.85±2.02倍，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。所以，長(zhǎng)春新堿可以有效上調(diào)MG63細(xì)胞內(nèi)caspase9mRNA表達(dá)量，是其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要原因。鑒于caspase9的促細(xì)胞凋亡作用，長(zhǎng)春新堿可顯著上調(diào)其mRNA表達(dá)水平，提示長(zhǎng)春新堿的抗腫瘤的另一作用機(jī)制是上調(diào)細(xì)胞內(nèi)caspase9的表達(dá)。

綜上所述，長(zhǎng)春新堿從較低濃度（10μg·L－1）開(kāi)始就能抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖，且遠(yuǎn)低于其引起機(jī)體中毒劑量，這些都提示長(zhǎng)春新堿作為治療骨肉瘤這類惡性腫瘤的化療藥物具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值；而其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制是通過(guò)下調(diào)c－myc mRNA表達(dá)水平，也是長(zhǎng)春新堿的抗腫瘤作用機(jī)制之一。在較低濃度（10μg·L－1）長(zhǎng)春新堿作用下即可引起細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞；而其引起細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)caspase9mRNA表達(dá)水平，這也是長(zhǎng)春新堿的抗腫瘤作用的另一機(jī)制。

［1］Scotlandi K，Picci P，Kovar H.Targeted therapies in bone sarcomas［J］.Curr Cancer Drug Targets，2009，9（7）：843.

［2］Bacci G，Lari S.Current treaunent of high grade osteosacoma of the extremity［J］.J Chemother，2001，13（3）：235.

［3］陳秀珍，朱大誠(chéng).長(zhǎng)春新堿抗白血病作用的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（11）：2720.

［4］黃 偉，張瑤珍，周劍鋒，等.長(zhǎng)春新堿對(duì)K562細(xì)胞plk1和γ－微管蛋白表達(dá)影響的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（3）：295.

［5］吳 江，錢(qián)寶華，劉書(shū)遜，等.長(zhǎng)春新堿載體紅細(xì)胞的體外抗腫瘤作用［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2005，30（7）：593.

［6］史泓瀏，王曉懷.微波和長(zhǎng)春新堿對(duì)白血病細(xì)胞的體外凈化研究［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，1999，27（3）：14.

［7］唐東平，李 力.異博定等藥物對(duì)人卵巢癌耐藥細(xì)胞系多藥耐受的逆轉(zhuǎn)作用［J］.實(shí)用癌癥雜志，1999，14（3）：191.

［8］盧 懿，侯世祥，陳 彤.長(zhǎng)春花抗癌成分長(zhǎng)春新堿研究的進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28（11）：1006.

［9］Murayama，T Kawasoe，Y Yamashita，et al.Efficacy of the thirdgeneration bisphosphonate risedronate alone and in combination with anticancer drugs against osteosarcoma cell lines［J］.Anticancer Res，2008，28（4B）：2147.

［10］Davies JH，Evans BA，Jenney ME，et al.In vitro effects of chemotherapeutic agents on human osteoblast－like cells［J］.Calcif Tissue Int，2002，70（5）：408.

［11］Oda Y，Matsumoto Y，Harimaya K，et al.Establishment of new multidrug－resistant human osteosarcoma cell lines［J］.Oncol Rep，2000，7（4）：859.

［12］張文濤，屠重棋，劉 洋，等.人成骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞系的建立［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2006，37（2）：262.

［13］Cenci T，Martini M，Montano N，et al.Prognostic relevance of c－Myc and BMI1expression in patients with glioblastoma［J］.Am J Clin Pathol，2012，138（3）：390.

［14］Sander S，Calado DP，Srinivasan L，et al.Synergy between PI3K signaling and MYC in Burkitt lymphomagenesis［J］.Cancer Cell，2012，22（2）：167.

［15］Hayashi K，Jutabha P，Endou H，et al.c－Myc is crucial for the expression of LAT1in MIA Paca－2human pancreatic cancer cells［J］.Oncol Rep，2012，28（3）：862.

［16］Li P，Nijihawan D，Budihardjo I，et al.Cytochreme C and dATP－dependent formation of Apaf－1／caspase－9complex initiates an apoptoic protease cascade［J］.Cell，1997，91：479.