李志剛，郝林，范濤，龐昆，韓從輝，

(1.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221009；2.徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221009)

·論 著·

腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對(duì)前列腺癌及膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用

李志剛1，郝林2，范濤2，龐昆2，韓從輝1，2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221009；2.徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221009)

目的:研究重組并純化的腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)蛋白對(duì)前列腺癌及膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法:將不同濃度的TRAIL蛋白與培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞(PC-3細(xì)胞)和膀胱癌細(xì)胞(5637細(xì)胞)共孵育24 h后，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡 。結(jié)果：PC-3細(xì)胞株中，與未處理組比較，TRAIL蛋白濃度在20、40、80、160 ng·ml-1時(shí)細(xì)胞增殖率均有顯著性差異；而在5637細(xì)胞株中，與未處理組比較，TRAIL蛋白濃度在5、10、20、40 ng·ml-1時(shí)細(xì)胞增殖率均有顯著性差異。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，隨 TRAIL蛋白濃度的增高，兩種腫瘤細(xì)胞凋亡率增加。結(jié)論：重組并純化TRAIL蛋白可通過(guò)抑制前列腺癌及膀胱癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤的作用。

腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體；前列腺癌；膀胱癌；增殖；凋亡

膀胱癌和前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率較高[1-3]。目前，對(duì)膀胱癌和前列腺癌主要采取手術(shù)治療為主，輔以化療、免疫治療、放療等聯(lián)合模式，然而這些療法都具有不可忽視的局限性。當(dāng)前生物治療在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中顯示了巨大的潛力，成為抑制腫瘤發(fā)展的一個(gè)新的方向。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis ligand， TRAIL)是已知的唯一高度特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響的蛋白質(zhì)分子，因此，在腫瘤治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[4-5]。本研究采用細(xì)胞生物學(xué)的方法研究TRAIL對(duì)前列腺癌及膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用，探討其抗腫瘤作用機(jī)制，為腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和人膀胱癌細(xì)胞株5637(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)，重組人TRAIL含胞外區(qū)片段第114～281位氨基酸并純化的GST-rTRAIL蛋白由前期實(shí)驗(yàn)獲得[6-7]；二氧化碳恒溫孵箱(Thermo Forna，美國(guó))；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；平底6孔板，96孔板(Coster，USA)；酶聯(lián)儀(Bio-Tek，美國(guó))；Cell Counting Kit8試劑盒(DOJINDO，日本)；Annexin Ⅴ試劑盒購(gòu)自Laboratories 公司。流式細(xì)胞分析儀(Coulter公司，USA)；胎牛血清(FCS) 、RPMI 1640 培養(yǎng)液，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌細(xì)胞PC3和前列腺癌細(xì)胞5637 在含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中37 ℃、5 %CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周2 次半量換液。

1.3 CCK8檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖情況

分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3和5637細(xì)胞以8×103ml-1接種于96孔板，12 h后實(shí)驗(yàn)組每孔加入不同濃度的TRAIL蛋白。5637細(xì)胞內(nèi)TRAIL蛋白濃度分別為1、5、10、20、40 ng·ml-1，PC-3細(xì)胞內(nèi)TRAIL蛋白濃度分別為10、20、40、80、160 ng·ml-1。培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK8試劑10 μl，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。以未加TRAIL蛋白的細(xì)胞為未處理細(xì)胞組，以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每組3孔。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(未處理細(xì)胞組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況

分別將PC-3和5637細(xì)胞以4×105ml-1接種于6孔板，12 h后5637細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組分別加入TRAIL蛋白5 ng·ml-1和10 ng·ml-1，PC-3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組分別加入TRAIL蛋白20 ng·ml-1和40 ng·ml-1，培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl， 混勻， 室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度TRAIL對(duì)PC-3和5637細(xì)胞增殖的影響

見(jiàn)表1。

結(jié)果顯示，TRAIL蛋白抑制了PC-3和5637細(xì)胞的增殖率，且隨濃度增加，腫瘤細(xì)胞增殖率降低。與未處理細(xì)胞組相比，PC-3細(xì)胞株中除10 ng·ml-1濃度的TRAIL蛋白外，其余各組細(xì)胞增殖率均明顯下降；而在5637細(xì)胞株中，除1 ng·ml-1TRAIL蛋白濃度外，其余各組細(xì)胞增殖率均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 CCK8檢測(cè)不同濃度TRAIL 對(duì)PC-3和5637的增殖率 %

與未經(jīng)TRAIL蛋白處理組比較， aP<0.05

2.2 TRAIL蛋白對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，TRAIL蛋白能明顯提高5637細(xì)胞的凋亡率，隨劑量增加，腫瘤細(xì)胞凋亡增加(圖1)。

2.3 TRAIL蛋白對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，TRAIL蛋白能明顯提高PC-3細(xì)胞的凋亡率，隨劑量增加，腫瘤細(xì)胞凋亡增加(圖2)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 5637細(xì)胞凋亡率

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡率

3 討 論

TRAIL 是TNF 超家族成員，它通過(guò)結(jié)合相應(yīng)的死亡受體TRAIL2R1 (DR4 ) 和TRAIL2R2 (DR5 )激活凋亡機(jī)制，選擇性地使癌細(xì)胞易于凋亡，而不損害正常細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，重組并純化的TRAIL蛋白主要通過(guò)誘導(dǎo)凋亡的方式來(lái)發(fā)揮對(duì)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和膀胱癌細(xì)胞株5637的抑制作用；這種抑制作用與TRAIL的濃度及腫瘤細(xì)胞的特性有關(guān)，不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的起始反應(yīng)劑量不同。本研究中，在低劑量TRAIL濃度作用下，兩種腫瘤細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象不明顯，同時(shí)，我們用流式細(xì)胞技術(shù)觀察了TRAIL誘導(dǎo)兩種腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，其結(jié)果與細(xì)胞增殖測(cè)試的結(jié)果一致，隨TRAIL劑量增加，腫瘤細(xì)胞凋亡顯著增加。

本研究顯示我們前期構(gòu)建、重組并純化的TRAIL蛋白能夠有效誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖，然而其長(zhǎng)期抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果目前尚不清楚。以往研究顯示，由于宿主抵抗作用，TRAIL 單藥治療存在腫瘤天然耐藥現(xiàn)象。近年來(lái)，有不少將TRAIL與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤的研究[8-9]報(bào)道。兩者聯(lián)合使用既能有效增強(qiáng)抑瘤效果，又能減少臨床上化療藥物的使用劑量，降低細(xì)胞的毒性。Shin等研究顯示，丹參酮1聯(lián)合TRAIL治療前列腺癌，通過(guò)上調(diào)miR135a-3p 表達(dá)促使DR5活性增高從而提高TRAIL誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[10]。Ismail等研究結(jié)果顯示，抗癌藥物RG003聯(lián)合TRAIL治療前列腺癌能夠提高TRAIL誘導(dǎo)凋亡的作用[11]。而有學(xué)者報(bào)道二甲雙胍、吳茱萸堿都可增強(qiáng)TRAIL對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的凋亡作用，通過(guò)mTOR/S6K1信號(hào)通路分別下調(diào)c-FLIP和Mcl-1表達(dá)水平[12-13]。因此我們構(gòu)建、重組并純化的TRAIL蛋白與化療藥物聯(lián)合使用能否長(zhǎng)期有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡以及其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

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Effect of TRAIL on the proliferation and apoptosis of prostate cancer and bladder cancer cells

LI Zhi-gang1，HAO Lin2，F(xiàn)AN Tao2，PANG Kun2，HAN Cong-hui1，2

(1.XuzhouMedicalCollege，Xuzhou221009，China; 2.XuzhouCentralHospital，Xuzhou221009，China)

Objective: To study the effect of purified tumor necrosis factor-related apoptosis ligand on the proliferation and apoptosis of prostate cancer cell(PC-3 cell) and bladder cancer cell(5637 cell). Methods: PC-3 and 5637 cell line were incubated with different concentrations of TRAIL protein for 24 h. Then cell proliferation and flow cytometry were employed to detect the PC-3 and 5637 proliferation and apoptosis.Results: The significant difference of the cell proliferation rate was found in PC-3 cells when the TRAIL protein concentration was 20，40, 80, 160 ng·ml-1compared with untreated group. In 5637 cells， the cell proliferation rate had significant difference when the TRAIL protein concentration was 5， 10， 20， 40 ng·ml-1compared with untreated group. Flow cytometry results also confirmed that the apoptosis rate of two kinds of tumor cell increased with the TRAIL protein dose dependently. Conclusion: Purified tumor necrosis factor-related apoptosis ligand protein can perform the anti-tumor role by inhibiting proliferation and inducing the apoptosis of the prostate cancer and bladder cancer cells.

tumor necrosis factor-related apoptosis ligand；prostate cancer; bladder cancer; proliferation; apoptosis

2014-11-02

2015-01-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272557)；徐州市中心醫(yī)院博士(碩士)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)科技基金資助項(xiàng)目(XZS2013004)；中美國(guó)際合作基金資助項(xiàng)目(2014DFA31480)

李志剛(1975-)，男，江蘇徐州人，副主任醫(yī)師,在讀碩士研究生。E-mail:zhigangl75@126.com

韓從輝 E-mail:zhigangl75@126.com

李志剛，郝林，范濤，等.腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對(duì)前列腺癌及膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：383-386.

R694

A

1671-6264(2015)03-0383-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.012