李亭亭，田高強(qiáng)，羅明久，黃麗波，葛利江

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

圍產(chǎn)期小鼠子宮頸中糖皮質(zhì)激素受體、11β羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)

李亭亭#，田高強(qiáng)#，羅明久，黃麗波，葛利江*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

旨在揭示糖皮質(zhì)激素(GC)及糖皮質(zhì)激素受體(GR)、11β羥基類固醇脫氫酶1和2(11βHSD-1和2)對圍產(chǎn)期小鼠子宮頸成熟的影響和機(jī)制。選取圍產(chǎn)期5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為產(chǎn)前48 h(-48 h)、產(chǎn)前24 h(-24 h)、分娩時(shí)(0 h)、產(chǎn)后12 h(+12 h) 和產(chǎn)后48 h(+48 h)。首先通過ELISA檢測血清皮質(zhì)酮濃度變化，再通過免疫組化對GR和影響GC活性的兩個(gè)酶，11βHSD-1和11βHSD-2，進(jìn)行免疫定位和半定量檢測。ELISA結(jié)果顯示圍產(chǎn)期GC濃度呈先升高后下降趨勢，分娩時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，11βHSD-1、11βHSD-2和GR在子宮頸腔上皮、基質(zhì)、血管和平滑肌細(xì)胞上均有分布，11βHSD-1/11βHSD-2平均光密度的比值呈現(xiàn)先升高再下降趨勢，分娩時(shí)比值最高；GR的表達(dá)量也是分娩時(shí)最高，分娩前后較低的趨勢(P<0.01)。以上結(jié)果提示11βHSD-1合成的糖皮質(zhì)激素通過其受體在子宮頸的成熟過程中起著關(guān)鍵性作用。

糖皮質(zhì)激素；11βHSD-1；11βHSD-2；糖皮質(zhì)激素受體；小鼠；免疫定位

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是腎上腺皮質(zhì)層束狀帶合成和分泌的一類甾體激素，在機(jī)體的代謝和應(yīng)激等過程中起著重要的作用。11βHSD-1和 11βHSD-2 是調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素活性的轉(zhuǎn)化酶，二者作用相反，分別可以活化/失活GC，共同調(diào)節(jié)局部組織細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素的活性。

糖皮質(zhì)激素受體(GR)是由核受體亞家族3C組成員1(NR3C1)編碼的一條多肽鏈組成的磷酸化蛋白質(zhì)，與GC結(jié)合形成GC-GR復(fù)合物，通過和靶基因中的GC反應(yīng)元件相互作用，最終引起各種生物學(xué)效應(yīng)[1]。研究表明，糖皮質(zhì)激素是參與分娩的重要激素[2]，綿羊、牛、小鼠等在妊娠晚期及分娩后胎盤、子宮、胎兒或母體血管中均有GR表達(dá)，GC與GR 結(jié)合可引起前列腺素分泌增加，促使宮縮加強(qiáng)[3-4]。

宮頸成熟(cervical ripening)是正常分娩的必要條件。目前研究表明，子宮頸成熟不是繼發(fā)于子宮收縮的被動(dòng)過程，而是一個(gè)多種內(nèi)分泌因素參與的主動(dòng)耗能[5]、炎性細(xì)胞浸潤的過程[6-7]。各種激素介質(zhì)通過直接或間接對宮頸內(nèi)免疫細(xì)胞的位置分布和相對數(shù)量的調(diào)控來發(fā)揮它們特有的生理功能使宮頸成熟軟化。其中糖皮質(zhì)激素及其受體和轉(zhuǎn)換它的兩個(gè)關(guān)鍵酶的作用一直備受關(guān)注，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在對這一機(jī)制進(jìn)行初步闡釋。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雌雄昆明小鼠，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，(80±5)日齡，體重40 g左右，其中雌鼠25只，雄鼠5只，給予充足的飲水和飼料，自然光照。將小鼠按雌雄3∶1的比例合籠。次日早晨發(fā)現(xiàn)陰道栓時(shí)記為妊娠第1天(D 1)，按采樣時(shí)期不同分為5組，分別為產(chǎn)前48 h(D17)和24 h(D18)、0 h (D19)、產(chǎn)后12 h和48 h。

1.2 試劑和儀器

小鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒(DZE 20546，上?；鶢栴D生物科技)；兔抗人糖皮質(zhì)激素受體多克隆抗體(ab 52190)、兔抗人11βHSD-1多克隆抗體(ab 39364)、兔抗人11βHSD-2多克隆抗體(ab 115696)(均購自英國Abcam公司)；超敏二步法免疫組化試劑盒(PV-9001，中山金橋)；DAB顯色試劑盒(PA 110，北京天根)。

LEICA石蠟切片機(jī)；Labsystems Multiskan MS公司的酶標(biāo)儀；Olympus顯微照相系統(tǒng)。

1.3 樣本采集和處理

所有小鼠摘除眼球采血，收集于干燥離心管中，室溫靜置30 min，1 000 r ·min-1離心10 min，取血清儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱，用于檢測血清皮質(zhì)酮濃度。采血后取小鼠新鮮子宮頸組織，生理鹽水沖洗，放于4%多聚甲醛，4 ℃固定48～72 h；固定后組織再經(jīng)水流沖洗1 d，酒精逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；連續(xù)切片，切片厚約4 μm，每隔5張取3張連續(xù)切片，用于免疫組化染色。

1.4 小鼠血清皮質(zhì)酮的檢測

應(yīng)用ELISA法分別檢測5組小鼠血清皮質(zhì)酮的含量，小鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒檢測濃度范圍為8～150 μg·L-1；在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，具體操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 免疫組化(間接法)檢測GR、11βHSD-1和11βHSD-2

1.5.1 主要染色步驟 切片常規(guī)脫蠟至水；0.8%胰蛋白酶消化修復(fù)抗原；含3% H2O2的甲醇溶液37 ℃濕盒內(nèi)避光孵育30 min；兔抗人糖皮質(zhì)激素受體多克隆抗體一抗工作液(1∶100稀釋)，4 ℃冰箱濕盒內(nèi)過夜孵育；相繼滴加超敏二步法免疫組化試劑盒試劑1和試劑2，于37 ℃溫箱中各孵育1 h。以上各步驟之間均以0.01 mol·L-1PBS 液充分洗滌3次，每次5 min。最后DAB顯色以及蘇木素復(fù)染，脫水，封片。

1.5.2 視野觀察與統(tǒng)計(jì) 使用顯微照相系統(tǒng)對子宮頸切片進(jìn)行圖像采集，每只小鼠取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，并在相同條件下拍照保存。用Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測定單位視野中GR陽性顆粒的光密度值，取5個(gè)視野的平均值定為該樣本的GR陽性顆粒的平均光密度值，平均光密度值越大表示蛋白含量越高。

11βHSD-1和2的免疫組化檢測步驟同上。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 小鼠血清皮質(zhì)酮濃度

產(chǎn)前48h、產(chǎn)前24h、分娩時(shí)、產(chǎn)后12h和產(chǎn)后48h血清皮質(zhì)酮分別為(124.22±2.82)、(123.87±3.31)、(136.15±3.79)、(135.74±2.72)和(131.30±2.10)μg·L-1。血清皮質(zhì)酮從產(chǎn)前48h至產(chǎn)前24h略有下降，二者差異不顯著(P>0.05)；產(chǎn)前24h到分娩時(shí)GC濃度迅速上升，達(dá)到峰值，二者差異極顯著(P<0.01)；產(chǎn)后12h時(shí)GC濃度略有降低，但與分娩時(shí)差異不顯著(P>0.05)；產(chǎn)后48h時(shí)GC濃度顯著下降，與其他四個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異極顯著(P<0.01)。

2.2 子宮頸中11βHSD-1和2的定位和半定量

免疫組化結(jié)果表明，11βHSD-1和11βHSD-2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，且主要為細(xì)胞核著色，陰性對照不著色(圖1F、f)。產(chǎn)前48h時(shí)11βHSD-1和2在子宮頸腔上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中有少量表達(dá)(圖1A、a)，從產(chǎn)前24h至產(chǎn)后48h在子宮頸中分布廣泛，子宮頸腔上皮和基質(zhì)細(xì)胞(圖1B、D、b、d、e)，血管內(nèi)皮(圖1D、E、d、e)以及子宮頸平滑肌細(xì)胞(圖1C、c、e)上均有分布，且主要分布在腔上皮和平滑肌細(xì)胞上。

平均光密度分析得出，產(chǎn)前48h至分娩期，11βHSD-1和11βHSD-2表達(dá)量逐漸升高，分娩時(shí)達(dá)到最大值(P<0.05)，產(chǎn)后12h表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，其中11βHSD-1表達(dá)量在產(chǎn)后48h降低到產(chǎn)前48h水平，兩者差異不顯著(P>0.05)，11βHSD-2表達(dá)量在產(chǎn)后12h與產(chǎn)后48h差異不顯著(P>0.05)，且維持在較高水平，但與產(chǎn)前48h相比差異極顯著(P<0.01) (圖2)。

2.3 子宮頸中GR的定位和半定量

GR蛋白定位在子宮頸細(xì)胞的細(xì)胞核中，細(xì)胞質(zhì)中也檢測到少量表達(dá)。經(jīng)免疫組化DAB染色的切片，GR免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞呈深淺不等的棕黃色(圖3)，陰性對照不著色(圖3F)。結(jié)果顯示，在產(chǎn)前48h時(shí)GR僅在子宮頸腔上皮細(xì)胞和基質(zhì)中少量表達(dá)(圖3A)；產(chǎn)前24h至產(chǎn)后48h，GR在子宮頸腔上皮和基質(zhì)細(xì)胞(圖3B，D)，腺管(圖3D)，血管內(nèi)皮(圖3D，E)以及子宮頸平滑肌細(xì)胞(圖3C，E)上均有分布，其中分娩時(shí)GR表達(dá)量最高。

Image-proplus6.0的分析顯示，產(chǎn)前48h、產(chǎn)前24h、分娩時(shí)、產(chǎn)后12h和產(chǎn)后48hGR陽性細(xì)胞在小鼠子宮頸組織中的平均光密度分別為(0.008±0.004) 、(0.034±0.017)、(0.062±0.015)、(0.039±0.016)和(0.016±0.007)IOD·Area-1。GR陽性細(xì)胞在產(chǎn)前48h表達(dá)水平較低，平均光密度值最小，產(chǎn)前24hGR表達(dá)量迅速上升(P<0.01)，分娩時(shí)上升到最高水平(P<0.01)。產(chǎn)后GR表達(dá)量迅速下降，其中分娩時(shí)與產(chǎn)后12h差異極顯著(P<0.01)，產(chǎn)后12h與產(chǎn)后48h差異極顯著(P<0.01)，且產(chǎn)后48hGR表達(dá)量接近產(chǎn)前48h(P>0.05) 。

上述結(jié)果表明小鼠圍產(chǎn)期5個(gè)時(shí)間點(diǎn)GR的平均光密度值呈現(xiàn)出先升高再降低。在分娩時(shí)GR的平均光密度值最高，與11βHSD-1/11βHSD-2的比值有著相似的變化趨勢。

3 討 論

糖皮質(zhì)激素(GC)分為皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮，在不同種屬動(dòng)物體內(nèi)分泌的種類和比例有所不同，牛、羊和人等體內(nèi)以皮質(zhì)醇為主，而鳥類、大鼠和小鼠、兔則以皮質(zhì)酮為主。GC的生物學(xué)效應(yīng)不僅取決于目標(biāo)組織中GR受體的表達(dá)量還取決于糖皮質(zhì)激素的代謝酶 (11βHSD-1和2)的表達(dá)含量與反應(yīng)方向。11βHSD-1和2可催化糖皮質(zhì)激素C11位的酮基與羥基之間的氧化還原反應(yīng)，其中11βHSD-1能使無活性的可的松(脫氫皮質(zhì)酮)還原為有活性的皮質(zhì)醇(皮質(zhì)酮)，而11βHSD-2的催化反應(yīng)方向相反，使有活性的糖皮質(zhì)激素失活。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，GR蛋白與11βHSD-1和2表達(dá)部位一致，在小鼠子宮頸內(nèi)膜基底層、間質(zhì)、腺管、血管以及子宮頸平滑肌都有分布，說明糖皮質(zhì)激素可通過自分泌或旁分泌的方式在子宮頸局部細(xì)胞內(nèi)起作用。小鼠圍產(chǎn)期5個(gè)時(shí)間點(diǎn)11βHSD-1和2的平均光密度曲線相似，說明11βHSD-1和2的表達(dá)量有著相似的變化趨勢，都是在分娩時(shí)表達(dá)量最高。同時(shí)11βHSD-1/11βHSD-2的比值也呈現(xiàn)出“先升高再降低”的趨勢。這與作者檢測的小鼠圍產(chǎn)期血清皮質(zhì)酮濃度的變化規(guī)律相符，說明在分娩時(shí)11βHSD-1/11βHSD-2比值達(dá)到最大值，皮質(zhì)酮活化反應(yīng)更占優(yōu)勢，子宮頸局部組織細(xì)胞中GC濃度上升，參與宮頸成熟擴(kuò)張。而在分娩前后皮質(zhì)酮失活反應(yīng)更占優(yōu)勢，子宮頸局部組織細(xì)胞中GC濃度下降，以減少糖皮質(zhì)激素對宮頸的擴(kuò)張作用，利于宮頸的產(chǎn)后修復(fù)。此外GR蛋白在分娩時(shí)表達(dá)水平的顯著升高，增加了子宮頸對GC的敏感性，進(jìn)一步加強(qiáng)GC對子宮頸成熟擴(kuò)張的作用。

1.腔上皮；2.基質(zhì)細(xì)胞；3.血管；4.平滑肌細(xì)胞；箭頭表示11βHSD-1和11βHSD-2陽性細(xì)胞1.Luminal epithelium；2.Stromal cells；3.Blood vessels；4.Smooth muscle cells；Arrows represent immune positive cells of 11βHSD-1 and 11βHSD-2圖1 圍產(chǎn)期小鼠子宮頸中11βHSD-1和11βHSD-2免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞Fig.1 Immune positive cells of 11βHSD-1 and 11βHSD-2 in murine uterine cervix during the peripartal period

雖然糖皮質(zhì)激素通過干擾NF-κB信號系統(tǒng)可抑制羊膜成纖維細(xì)胞以及大多數(shù)其他類型細(xì)胞內(nèi)前列腺素合成酶(PTGS 2)的表達(dá)[8]，降低前列腺素濃度，但是在滋養(yǎng)層中包括羊膜和絨毛膜，糖皮質(zhì)激素卻可刺激PTGS 2表達(dá)和活性[9-12]。皮質(zhì)醇可刺激羊膜PTGS 2轉(zhuǎn)錄以增強(qiáng)前列腺素的合成，并抑制絨毛膜前列腺素脫氫酶的活性從而抑制前列腺素代謝[13，15]。此外，糖皮質(zhì)激素在分娩期可直接上調(diào)胎膜中前列腺素的合成[13-14]。

圖2 子宮頸中11βHSD-1 和2免疫陽性細(xì)胞的平均光密度及11βHSD-1/11βHSD-2比值Fig.2 The mean optical density of 11βHSD-1 and 2 immunopositive cells in the uterine cervix and the quotient between mean optical density of 11βHSD-1 and 2

A.產(chǎn)前48 h；B.產(chǎn)前24 h；C.分娩期；D.產(chǎn)后12 h；E.產(chǎn)后48 h；F.陰性對照；1.腔上皮；2.基質(zhì)細(xì)胞；3.血管；4.平滑肌細(xì)胞；5.腺管；箭頭表示GR陽性細(xì)胞A.48 h antepartum；B.24 h antepartum；C.Term labor；D.12 h postpartum；E.48 h postpartum；F.Negative control；1.Luminal epithelium；2.Stromal cells；3.Blood vessels；4.Smooth muscle cells；5.Glandular epithelium；Arrows represent immune positive cells of GR圖3 圍產(chǎn)期小鼠子宮頸組織中GR免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞Fig.3 Immune positive cells of GR in murine uterine cervix during the peripartal period

而前列腺素在分娩啟動(dòng)和延續(xù)中起著關(guān)鍵作用，已有研究證明，內(nèi)源性前列腺素PGE 2參與宮頸成熟[16]。PGE 2可破壞子宮頸上皮細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)和結(jié)締組織中的膠原纖維和彈性蛋白[17]，使結(jié)締組織和上皮變得松散軟化。分娩時(shí)PGE 2主要產(chǎn)生于羊膜，絨毛膜，蛻膜組織還有母體胎盤[ 18-20 ]。我們另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在分娩時(shí)PGE 2在宮頸組織中分布廣泛，除了存在于脂肪細(xì)胞外，還存在于腔上皮、血管，腺管，平滑肌和漿膜[5]，說明子宮頸也是PGE 2旁分泌或自分泌的部位。因此，推斷子宮頸局部組織中由11βHSD-1和2共同調(diào)節(jié)的糖皮質(zhì)激素及其受體與宮頸內(nèi)PGE 2有密切聯(lián)系，糖皮質(zhì)激素在分娩期可能是通過增加子宮頸局部組織PGE 2的濃度使子宮頸成熟擴(kuò)張。

顧國生等已證明[5]，山羊子宮頸平滑肌中前列腺素松弛型受體EP 2和EP 4蛋白在分娩期的表達(dá)量顯著升高，這與小鼠子宮頸中的糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)規(guī)律也相符。PGE 2通過與其受體EP 1、EP 2、EP 3和EP 4結(jié)合使分娩正常啟動(dòng)。PGE 2與EP 2、EP 4結(jié)合后刺激腺苷酸環(huán)化酶的分泌，通過提高cAMP的分泌來誘導(dǎo)子宮頸平滑肌松弛[21]。此外，有研究表明糖皮質(zhì)激素可通過增加離體培養(yǎng)的子宮平滑肌組織中的前列腺素水平而增加子宮的收縮力[22]。糖皮質(zhì)激素在子宮組織中產(chǎn)生的不同生物學(xué)效應(yīng)可能與前列腺素受體在不同組織中的特異性表達(dá)相關(guān)。不同組織細(xì)胞分泌的PGE 2可以通過跨膜G蛋白偶聯(lián)EP超家族來激活不同細(xì)胞內(nèi)通路以引起子宮和宮頸的收縮或松弛[23-25]。分娩期子宮組織中前列腺素受體EP 1和EP 3大量表達(dá)分布，其中EP 1是收縮性受體，前列腺素通過與其結(jié)合直接使子宮收縮，而EP 3是通過降低cAMP的表達(dá)來抑制子宮平滑肌的舒張來間接使子宮處于收縮狀態(tài)。

4 結(jié) 論

分娩時(shí)子宮頸局部組織中由11βHSD-1合成糖皮質(zhì)激素及其受體大量增加使子宮頸成熟軟化，分娩后子宮頸局部組織糖皮質(zhì)激素水平的降低使子宮頸恢復(fù)到分娩前的狀態(tài)，因此糖皮質(zhì)激素及其受體與小鼠子宮頸成熟有密切關(guān)系。

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(編輯 白永平)

Expression of Glucocorticoids Receptor，11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase in the Cervices of Peripartal Mice

LI Ting-ting#，TIAN Gao-qiang#，LUO Ming-jiu，HUANG Li-bo，GE Li-jiang*

(CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

The present study was designed to examine the pattern and cellular localization of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase(11β-HSD) enzymes and glucocorticoids receptor(GR) gene expression in the murine cervix during peripartal period，and to gain insight into the role of glucocorticoid(GC) and GR，11β-HSD-1 and 2 in the cervical ripening of peripartal mice.Mice in five groups were from 48 h before birth(-48 h) and-24 h，at term labor(0 h)，12 h after birth(+12 h) and +48 h.The dynamic change of the serum corticosterone level was determined by ELISA and immunolocalization of GR，11βHSD-1 and 2 which influence glucocorticoid’s activity in cervix was assayed by immunohistochemistry.The results suggested that the levels of serum corticosterone were significantly increased before the onset of labor，reached the maximum during delivery(P<0.01).In addition，the 11βHSD-1，11βHSD-2 and GR protein were localized to the nuclei of cervical luminal epithelia，stromal cells，vascular and cervical smooth muscles.The quotient between mean optical density of 11βHSD-1 and 2 is highest at parturition.Furthermore，the immunoreactivity of GR also reached the peak at parturition(P<0.01).These results revealed that 11βHSD-1-regenerated glucocorticoids may act via its receptor to play an important role in the final cervical ripening.

glucocorticoids；11βHSD-1；11βHSD-2；glucocorticoid receptor；mice；immunolocalization

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.024

2015-03-04

山東省自然科學(xué)基金(ZR2010CM052)

李亭亭(1989-)，女，山東嘉祥人，碩士，主要從事動(dòng)物生殖疾病與生殖內(nèi)分泌的研究，E-mail：litingting0516@126.com。田高強(qiáng)為共同第一作者

*通信作者：葛利江，E-mail：glj@sdau.edu.cn

S857.2

A

0366-6964(2015)11-2097-07