宋仕玲，桂文甲，周洪清，黃藝芬，尹淑芬，李 靖，吳淑坤

武警湖北總隊(duì)醫(yī)院感染科，湖北 武漢430061

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型測(cè)定對(duì)評(píng)估慢性乙型肝炎感染者的疾病進(jìn)展和制定最佳抗病毒治療方案很重要，相比而言，肝硬化和原發(fā)性肝癌患者感染的乙型肝炎病毒基因分型更多為基因C型和D 型［1-3］。核苷(酸)類藥物(nucleostide analogues，NAs)作為抗乙型肝炎病毒藥物，廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒所致各種慢性肝病的治療，HBV 耐藥是慢性乙型肝炎抗病毒治療中的重要問題，了解HBV 耐藥突變位點(diǎn)，有助于制定和調(diào)整慢性乙型肝炎感染者的抗病毒治療措施［4］。本文對(duì)武漢地區(qū)157 例慢性乙型肝炎患者的HBV 基因型分布及其耐藥性情況分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩選有完整基因分型的157 例武漢地區(qū)慢性乙型肝炎患者，其血清標(biāo)本由深圳華大基因研究院于2011 年7 月-2013 年4 月收集，男130 例(82.80%)，女27 例(17.20%)，年齡17 ～73 歲，平均年齡(43.08 ±16.02)歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版本)》［5］。抽取外周靜脈血5 ml，分離血清置-20 ℃存儲(chǔ)備用。

1.2 儀器 PTC200 PCR 擴(kuò)增儀(BioRad 公司)，ABI 3730 XL 測(cè)序儀(美國ABI 公司)，Tannon 1600 數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tannon 公司)，DYY-6C 型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 試劑 北京天根生化科技有限公司TIANamp 病毒基因組DNA 提取試劑盒，大連Takara Taq 酶，大連TakaraDL2000 DNA Marker，大連Takara 隨機(jī)引物(6 mer)，大連Takara dNTP Mixture(10 mm)，大連Takara Premix PrimerSTAR HS。

1.4 方法

1.4.1 HBV DNA 提取:嚴(yán)格按照TIANamp 病毒基因組DNA 提取試劑盒說明書操作提取DNA 溶液。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增:按照試劑盒操作說明書，將反應(yīng)試劑和引物按照順序依次加入EP 管內(nèi)，震蕩混勻后離心10 s，將配置好的PCR Mix 分裝于96 孔板上，加入DNA 溶液，用封口膜封口，離心4 000 r/min，1 min，將標(biāo)本置入PCR 擴(kuò)增儀擴(kuò)增進(jìn)行PCR 反應(yīng)。將5 μl PCR 產(chǎn)物和酶標(biāo)板中2 μl Buffer 混合，將瓊脂凝膠放入電泳槽，點(diǎn)樣5 μl DL2000 DNA Marker 于瓊脂凝膠中電泳。將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染液中，染色10 ～15 min，凝膠拍照成像。

1.4.3 將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化處理:3730 XL 測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，下機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，解讀下機(jī)數(shù)據(jù)，NCBI 在線基因分型工具(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)對(duì)上述所得序列進(jìn)行對(duì)比，獲得HBV 基因分型結(jié)果，分析耐藥位點(diǎn)的突變情況，耐藥位點(diǎn)出現(xiàn)突變峰則定性為產(chǎn)生變異，此位點(diǎn)出現(xiàn)耐藥，生成檢測(cè)報(bào)告。

1.4.4 HBV 基因型和耐藥位點(diǎn)檢測(cè)目標(biāo):共檢測(cè)8個(gè)HBV 基因型，即A ～H 型。檢測(cè)HBV 11 個(gè)耐藥位點(diǎn):rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236 和rtM250。

1.5 HBV 耐藥變異位點(diǎn)和核苷類似物之間關(guān)系判斷 根據(jù)《乙型肝炎病毒耐藥專家共識(shí):2009 年更新》［6］，拉 米 夫 定 耐 藥 相 關(guān) 變 異 為rtM204I/V ±rtL180M，其中rtM204V 多與rtL180M 變異聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I 變異可單獨(dú)出現(xiàn);阿德福韋酯耐藥相關(guān)變異為rtN236T 與rtA181V/T 變異，兩個(gè)位點(diǎn)變異可單獨(dú)或聯(lián)合出現(xiàn);恩替卡韋耐藥相關(guān)變異為rtM204V +rtL180M變異基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtT184、rtS202 或rtM250 三個(gè)位點(diǎn)中至少一個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替代變異;與替比夫定耐藥相關(guān)變異為rtM204I。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 157 例患者HBV 基因型結(jié)果 157 例患者共檢測(cè)出3 種HBV 基因型，其中B 型114 例(72.61%)，C型42 例(26.75%)，D 型1 例(0.64%)。未測(cè)出A、E、F、G、H 型。

2.2 HBV 耐藥性結(jié)果 157 例患者中共有68 例(43. 31%)耐藥，其中B 型48 例，占耐藥病例的70.59%，占B 型病例的42.11%;C 型20 例，占耐藥病例的29.41%，占C 型病例的47.62%;統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)提示基因B 型和C 型的HBV 耐藥發(fā)生相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.379，P ＞0.05)。對(duì)拉米夫定耐藥41例，占耐藥病例的60.29%，其中B 型30 例(73.17%)，C 型11 例(26.83%);204I 位點(diǎn)耐藥17 例(B 型14例，C 型3 例)，180M+204I 位點(diǎn)耐藥6 例(B 型2 例，C 型4 例)，180M+204V 位點(diǎn)耐藥12 例(B 型9 例，C型3 例)，180M +204V/I 位點(diǎn)耐藥6 例(B 型5 例，C型1 例)。對(duì)阿德福韋酯耐藥20 例，占耐藥病例的29.41%，基因B 型15 例(75. 0%)，基因C 型5 例(25.0%);耐藥位點(diǎn)為236T 9 例，均為基因B 型，耐藥位點(diǎn)為181T/V 7 例，基因B 型4 例，基因C 型3 例，236T 和181T/V 聯(lián)合耐藥4 例，基因B 型和C 型各2例。對(duì)恩替卡韋耐藥5 例，占耐藥病例的7.35%，基因B 型3 例(耐藥位點(diǎn):180M +204V +184I +202G、180M+204V +202G、180M +204V/I +250V)，基因C型2 例(耐藥位點(diǎn):180M+204I +184I、180M+204V+184I+202G)。拉米夫定和阿德福韋酯聯(lián)合耐藥2 例，占耐藥病例的2. 94%，均為基因C 型，耐藥位點(diǎn)為180M+181I +204V、181T +204I。替比夫定耐藥與其他核苷類似物耐藥分析結(jié)果重復(fù)，共32 例(47.06%)，基因B 型24 例，基因C 型8 例;單獨(dú)204I 位點(diǎn)變異17例，204I 位點(diǎn)聯(lián)合其他位點(diǎn)變異15 例。

3 討論

目前已經(jīng)確定10 種HBV 基因型和超過30 種基因亞型分布于全球不同地區(qū)，依據(jù)HBV 全基因組核苷酸序列中核苷酸差異≥8%分為不同基因型［7］，4% ～8%的核苷酸差異分為不同基因亞型，除了已廣為人知的A ～H 型外，兩個(gè)新的基因型I 和J 已經(jīng)被確認(rèn)［8-9］。一項(xiàng)中國的HBV 基因型流行病學(xué)調(diào)查顯示中國南方主要分布HBV 基因B 型，而北方多為基因C型［10］。劉艾芹等［11］檢測(cè)深圳地區(qū)157 例CHB 患者基因型，發(fā)現(xiàn)基因B 型占61.53%，基因C 型占37.17%。而本研究檢測(cè)華中地區(qū)的武漢市157 例患者，發(fā)現(xiàn)共檢測(cè)出3 種HBV 基因型，基因B 型占72.61%，C 型占26.75%，D 型占0.64%，未測(cè)出A、E、F、G、H 型，提示武漢地區(qū)HBV 基因分型以B 型為主。

目前常用基因型耐藥檢測(cè)技術(shù)有PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性、反向雜交法、實(shí)時(shí)PCR、基因芯片、限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)，其中PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法可檢測(cè)已知和可能的未知耐藥變異位點(diǎn)，是最常用的基因型耐藥檢測(cè)方法之一［6］。本研究采用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)157 例患者中共有68 例耐藥，占43.31%，其中B型48 例，占耐藥病例的70. 59%，占B 型病例的42.11%;C 型20 例，占耐藥病例的29.41%，占C 型病例的47.62%，基因C 型和基因B 型HBV 相比，發(fā)生耐藥的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與其他研究結(jié)果不一致［10-11］。

拉米夫定是最早應(yīng)用于臨床的NAs 藥物，臨床使用廣泛，但耐藥率較高［6］。拉米夫定耐藥發(fā)生機(jī)制為HBV DNA 聚合酶基因發(fā)生突變所致，以C 區(qū)的YMDD變異為主，表現(xiàn)形式為YIDD 或YVDD 變異［11］。本研究發(fā)現(xiàn)68 例耐藥患者中對(duì)拉米夫定耐藥最多，為60.29%，其中B 型30 例(73.17%)，C 型11 例(26.83%)。分析其耐藥特點(diǎn)，表現(xiàn)為YIDD 變異即204I 位點(diǎn)耐藥17 例(B 型14 例，C 型3 例)，表現(xiàn)為YVDD 和YMDD 變異共24 例，即180M +204I 位點(diǎn)耐藥6 例(B 型2 例，C型4 例)、180M+204V 位點(diǎn)耐藥12 例(B 型9 例，C 型3 例)、180M+204V/I 位點(diǎn)耐藥6 例(B 型5 例，C 型1 例)。

阿德福韋酯常見耐藥相關(guān)變異為rtN236T 和/或rtA181V/T 變異［6］。本研究結(jié)果顯示68 例HBV 耐藥患者中，對(duì)阿德福韋酯耐藥20 例(占29.41%)，其中以基因B 型為主(75.0%)。耐藥位點(diǎn)為236T 9 例，均為基因B 型;耐藥位點(diǎn)為181T/V 7 例，基因B 型4例，基因C 型3 例;236T 和181T/V 聯(lián)合耐藥4 例，基因B 型和C 型各2 例。有研究［12］對(duì)比阿德福韋酯耐藥的HBeAg 陽性慢性乙型肝炎患者選用替比夫定聯(lián)合阿德福韋酯治療(30 例)和恩替卡韋單藥治療(28例)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，治療48 周后，兩組患者HBV DNA 低于3 log10copies/ml 比率、病毒學(xué)突破和耐藥發(fā)生情況相似，均無嚴(yán)重不良反應(yīng)，但替比夫定聯(lián)合阿德福韋酯組有6 例(20%)患者出現(xiàn)HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換，恩替卡韋組未出現(xiàn)HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

恩替卡韋的抗病毒作用強(qiáng)、耐藥變異發(fā)生率低［5］，HBV 基因組需要至少3 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異才會(huì)對(duì)恩替卡韋耐藥，其1 ～5 年累計(jì)耐藥發(fā)生率分別為0.2%、0.5%、1.2%、1.2%與1.2%［6］。本研究顯示68 例耐藥患者中對(duì)恩替卡韋耐藥發(fā)生率較低，共5例，占7.35%，基因B 型3 例，基因C 型2 例。

替比夫定常見耐藥相關(guān)變異為rtM204I，其他位點(diǎn)尚存在爭(zhēng)議［6］。本研究68 例HBV 耐藥患者中，替比夫定耐藥共32 例，其中基因B 型24 例，基因C 型8例。單獨(dú)204I 位點(diǎn)變異17 例，204I 位點(diǎn)聯(lián)合其他位點(diǎn)變異15 例。有研究［13］對(duì)比替比夫定和恩替卡韋治療乙肝代償期肝硬化2 年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恩替卡韋降低HBV DNA 至檢測(cè)不到水平及病毒耐藥情況都顯著好于替比夫定組，兩種藥物對(duì)降低HBsAg 水平、肝細(xì)胞癌發(fā)展、病死率、疾病進(jìn)展和腎功能變化方面都有相似作用，對(duì)于需要終生治療患者不宜將替比夫定作為一線藥物。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)157 例患者中基因B型最多，其次為基因C 型，發(fā)現(xiàn)1 例基因D 型，68 例耐藥患者其HBV 對(duì)拉米夫定和替比夫定耐藥率較高。了解慢性HBV 感染者的HBV 基因型和HBV 耐藥突變情況，有助于初步預(yù)測(cè)病情變化，為患者制定科學(xué)化個(gè)體治療方案。

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