陳曉敏，羅 云，江 敏，吳躍龍，施月芳，桂 琴

1.上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院內(nèi)科，上海201805;2.上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院嘉定分院病理科

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種常見的功能性胃腸?。?］，以反復(fù)腹痛、腹瀉、便秘、腹脹等為主要表現(xiàn)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為胃腸動(dòng)力障礙和內(nèi)臟高敏感等是引起IBS 的關(guān)鍵因素。近年來認(rèn)為腦腸軸調(diào)節(jié)失調(diào)是主要原因［2］。褪黑素(melatonin，MT)是腦腸軸中神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一，具有多種神經(jīng)內(nèi)分泌作用，如何通過MT 調(diào)節(jié)胃腸功能的具體機(jī)制尚不清楚，本課題通過研究MT 與IBS 的關(guān)系來探討IBS 的發(fā)病機(jī)制，為IBS 治療提供方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2011 年8 月-2014 年2 月上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院消化內(nèi)科IBS 患者90 例，男51例，女39 例，年齡20 ～70 歲，平均年齡(49. 13 ±14.60)歲，診斷符合功能性胃腸病羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)［3］。入選病例排除消化道及其他器質(zhì)性疾病史，無近期服藥史。腹瀉型IBS(IBS-D)46 例，男28 例，女18 例，平均年齡(50.89 ±14.98)歲;便秘型IBS(IBS-C)44 例，男23 例，女21 例，平均年齡(47.29 ±14.11)歲。所有患者均簽署知情同意書。對(duì)照組19 名，男9 名，女10名，年齡21 ～67 歲，平均年齡(48.42 ±15.02)歲，均為同期正常體檢者、健康志愿者，均有正常完整的結(jié)腸，現(xiàn)無任何腸道疾病癥狀。

1.2 主要試劑 兔抗人MR(美國(guó)Zeta 公司產(chǎn)品)和二步法免疫組化試劑盒(上海長(zhǎng)嘉生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理和染色:所有受檢者結(jié)腸鏡檢查前口服甘露醇500 ml+5%葡萄糖氯化鈉1 000 ml 清潔腸道，然后進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查。所有檢查者結(jié)腸鏡下黏膜均正常，受檢者在距肛門20 cm 處取結(jié)腸黏膜2 塊，立即放入10%中性緩沖甲醛液中固定，送檢病理科進(jìn)行標(biāo)本處理:常規(guī)脫水、石蠟固定、包埋、切片。1 塊活檢黏膜常規(guī)HE 染色，1 塊利用特殊抗體作MR 免疫組化染色。組織學(xué)檢查由同一名病理醫(yī)師完成。MR 試劑為美國(guó)Zeta 公司生產(chǎn)的兔抗人MR 抗體。MR 免疫組化染色由嘉定區(qū)中心醫(yī)院病理科協(xié)作完成。免疫組化采用二步法實(shí)驗(yàn)步驟:操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，高溫高壓抗原修復(fù)，3% H2O2液10 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 液沖洗3 次，滴加二抗(Ms/Ra-HRP)，孵育30 min，PBS 沖洗3 次，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明、封片。用PBS 液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 染色結(jié)果判斷:免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞染色結(jié)果分析采用粗略計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)清點(diǎn)5 個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)取平均值。染色結(jié)果判斷:MR 陽性反應(yīng)顆粒呈棕黃色或棕褐色，對(duì)照片為陰性反應(yīng)。MR 分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，偶見細(xì)胞核內(nèi)著色。判定標(biāo)準(zhǔn):陽性著色在黏膜表層細(xì)胞，陽性細(xì)胞總數(shù)≤1 為(-)，記1分;陽性著色在黏膜表層細(xì)胞和黏膜腺體細(xì)胞，且每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)量5 個(gè)(含5 個(gè))以下記2 分;陽性著色在黏膜表層細(xì)胞和黏膜腺體細(xì)胞，且每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)量6 ～10 個(gè)(含10 個(gè))記3 分;陽性著色在黏膜表層細(xì)胞和黏膜腺體細(xì)胞且每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)量在10 個(gè)以上記4 分。

1.3.3 問卷表:制定有關(guān)IBS 癥狀評(píng)分問卷表(IBSSESQ)［4］，包括腹痛、腹脹、排便性狀、排便感覺、生活質(zhì)量，上述每個(gè)癥狀按0 ～10 等級(jí)記分，0:無不適，10:最嚴(yán)重，計(jì)算總IBS 癥狀積分，＞20 分提示明顯的腸功能異常;各項(xiàng)分值越大提示嚴(yán)重程度越大。所有IBS 患者受檢前完成問卷表。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s 表示，IBS 組與正常對(duì)照組之間、IBS亞組間進(jìn)行MR 差異性分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA);IBS 癥狀評(píng)分與MR 間相關(guān)性的分析采用Pearson 相關(guān)系數(shù)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 IBS 組與正常對(duì)照組間、IBS-D 與IBS-C 組間性別構(gòu)成和年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。所有受檢者結(jié)腸鏡檢查中均未見異常，結(jié)腸黏膜活檢標(biāo)本常規(guī)HE 染色組織學(xué)檢查無異常。兩組患者組織學(xué)檢查均無顯著性差異。

2.2 結(jié)腸黏膜MR 陽性細(xì)胞數(shù)量比較 對(duì)照組結(jié)腸黏膜MR 表達(dá)為2.05 ±0.78;IBS-D 組為1.41 ±0.50;IBS-C 組為2.48 ±0.63;IBS-D 組、IBS-C 組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 MR 與IBS 癥狀程度相關(guān)性分析 總體IBS 組癥狀積分(21.89 ±2.11)與MR 表達(dá)(1.93 ±0.78)相關(guān)(P = 0. 024，r = 0. 238)。IBS-C 組癥狀積分(21.57 ± 2. 06)與MR 表達(dá)相關(guān)(P = 0. 012，r =0.376)。IBS-D 組癥狀積分(22.20 ±2.14)與MR 表達(dá)無相關(guān)性(P=0.86)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)IBS 組與正常對(duì)照組間結(jié)腸黏膜MR表達(dá)有差異。IBS-C 患者M(jìn)R 表達(dá)明顯高于對(duì)照組，對(duì)照組MR 表達(dá)高于IBS-D 組，這與Stepień 等［5］研究一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)IBS 組癥狀積分與MR 表達(dá)相關(guān)。

MT 是由哺乳動(dòng)物和人類的松果體分泌的一種吲哚類激素。Bubenik 等［6］首先報(bào)道褪黑激素在腸道黏膜的存在。這一觀察結(jié)果后來被免疫組織化學(xué)和放射免疫分析技術(shù)證實(shí)［7］。MT 在胃腸道大量分布，它的量是血液中的100 倍，是松果體的400 倍［8］。褪黑激素由腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cell，EC)合成［9］，通過激活特定的膜受體(melatonin receptor，MR)發(fā)揮它的一些生理效應(yīng)。MT 可分為MT1、MT2 和MT3 亞型。MT 具有高親脂性，因此可能會(huì)擴(kuò)散到更深的層次，通過黏膜和黏膜下層，最終作用于黏膜肌層或肌間神經(jīng)叢。許多文獻(xiàn)［10］報(bào)道了MT 對(duì)胃腸道收縮和松弛作用，但對(duì)胃腸道的作用部位及機(jī)制尚不清楚。

MT 最大可能通過激活胃腸平滑肌細(xì)胞膜上的MR 改變胃腸道蠕動(dòng)，并有強(qiáng)有力的證據(jù)表明結(jié)合位點(diǎn)MT2 受體。體內(nèi)動(dòng)物研究表明，MT 對(duì)腸道興奮性和抑制效果取決于MT 的劑量。小劑量的MT 加速大鼠腸道傳輸，而高劑量則有抑制腸道傳輸作用。這些影響被luzindole 阻斷，提示腸道MR 的參與［11］。結(jié)合本研究中IBS-C 組MR 表達(dá)高于正常對(duì)照組，而正常對(duì)照組高于IBS-D 組，推測(cè)IBS-C 組高劑量MT 抑制腸道傳輸，導(dǎo)致便秘，IBS-D 組小劑量MT 加速腸道傳輸導(dǎo)致腹瀉。

在電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明，MT 抑制平滑肌結(jié)電位的氮成分，這可能是由MT 在腸溶性突觸直接抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性的結(jié)果。其他研究表明，MT 可能阻礙N 型通道或通過與Ca2+激活的K+通道相互作用來調(diào)節(jié)胃腸功能［12］。

MT 的其他作用靶點(diǎn)可能是5-HT 受體。一項(xiàng)研究表明，高劑量的MT 在胃腸道中與縮膽囊素-2 和5-HT 受體上的迷走神經(jīng)傳入纖維相互作用，從而誘導(dǎo)經(jīng)迷走神經(jīng)抑制反射［13］。有報(bào)道［14］證明MT 通過拮抗5-HT 受體產(chǎn)生松弛作用。MT 能抑制5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，控制5-HT 在腸上皮細(xì)胞的再攝取，并通過作用于黏膜層的MT3 受體抑制NK2 受體觸發(fā)的結(jié)腸黏膜5-HT 釋放［15］。這些作用可能會(huì)同時(shí)影響腸道的分泌。結(jié)合本研究IBS-C 患者M(jìn)R 高表達(dá)，推測(cè)MT 拮抗5-HT 作用，導(dǎo)致便秘癥狀，相反，IBS-D 患者M(jìn)R 低表達(dá)，MT 拮抗5-HT 作用弱，導(dǎo)致腹瀉癥狀。

MT 參與腸道離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控。外源性MT 可減輕小鼠結(jié)腸炎腹瀉，但所涉及的機(jī)制尚未完全闡明［16］。在結(jié)腸，MT 被認(rèn)為調(diào)節(jié)氯的分泌［17］。MT 可以影響COX-2 和iNOS 的表達(dá)和調(diào)節(jié)小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸由前列腺素E 誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌。其中部分分泌的影響似乎局限于結(jié)腸上皮細(xì)胞涉及cAMP 途徑，而另一些涉及到腸神經(jīng)系統(tǒng)［18］。根據(jù)這些研究，提示MT 是下消化道離子運(yùn)輸?shù)纳碚{(diào)節(jié)劑。結(jié)合本研究推測(cè)IBSC 患者M(jìn)T 高表達(dá)，可能MT 對(duì)腸道離子調(diào)控，減少腸道分泌導(dǎo)致便秘。

本研究提示IBS 癥狀與結(jié)腸黏膜MR 表達(dá)相關(guān)。多項(xiàng)臨床研究提示MT 可改善IBS 癥狀［19-20］。有文獻(xiàn)［21］表明，MT 的鎮(zhèn)痛效果不是通過MR 介導(dǎo)，而是通過脊椎上通路連接到中央阿片系統(tǒng)中。因此，MT 對(duì)IBS 的作用既有對(duì)胃腸道組織各種直接影響，又有中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與。

綜上所述，IBS 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，越來越多的研究表明MT 作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素在IBS 發(fā)病機(jī)制中起重要作用，也提示MT 是一種治療IBS 有前景的藥物。

［1］ Choung RS，Locke GR 3rd. Epidemiology of IBS［J］. Gastroenterol Clin North Am，2011，40(1):1-10.

［2］ Mayer EA，Tillisch K. The brain-gut axis in abdominal pain syndromes［J］. Annu Rev Med，2011，62:381-396.

［3］ Drossman DA. The functional gastrointestinal disorders and the RomeⅢprocess［J］. Gastroenterology，2006，130(5):1377-1390.

［4］ Francis CY，Morris J，Whorwell PJ. The irritable bowel severity scoring system:a simple method of monitoring irritable bowel syndrome and its progress ［J］. Aliment Pharmacol Ther，1997，11 (2):395-402.

［5］ Stepień A，Moskwa-Fortuna A，Wisniewska-Jarosińska M，et al. Melatonin secretion and metabolism in patients with irritable bowel syndrome［J］. Pol Merkur Lekarski，2009，26(155):440-443.

［6］ Bubenik GA，Brown GM，Bubenik AB，et al. Immunohistological localization of testosterone in the growing antler of the white-tailed deer(Odocoileus virginianus)［J］. Calcif Tissue Res，1974，14(2):121-130.

［7］ Menendez-Pelaez A，Poeggeler B，Reiter RJ，et al. Nuclear localization of melatonin in different mammalian tissues:immunocytochemical and radioimmunoassay evidence［J］. J Cell Biochem，1993，53(4):373-382.

［8］ Bubenik GA. Gastrointestinal melatonin:localization，function，and clinical relevance［J］. Dig Dis Sci，2002，47(10):2336-2348.

［9］ Kvetnoy IM，Ingel IE，Kvetnaia TV，et al. Gastrointestinal melatonin:cellular identification and biological role［J］. Neuro Endocrinol Lett，2002，23(2):121-132.

［10］ Storr M，Schusdziarra V，Allescher HD. Inhibition of small conductance K+-channels attenuated melatonin-induced relaxation of serotonin-contracted rat gastric fundus ［J］. Can J Physiol Pharmacol，2000，78(10):799-806.

［11］ Drago F，Macauda S，Salehi S. Small doses of melatonin increase intestinal motility in rats［J］. Dig Dis Sci，2002，47(9):1969-1974.

［12］ Velarde E，Alonso-Gómez AL，Azpeleta C，et al. Melatonin attenuates the acetylcholine-induced contraction in isolated intestine of a teleost fish［J］. J Comp Physiol B，2009，179(8):951-959.

［13］ Kasimay O，Cakir B，Devseren E，et al. Exogenous melatonin delays gastric emptying rate in rats:role of CCK2 and 5-HT3 receptors［J］.J Physiol Pharmacol，2005，56(4):543-553.

［14］ Velarde E，Delgado MJ，Alonso-Gómez AL. Serotonin-induced contraction in isolated intestine from a teleost fish (Carassius auratus):characterization and interactions with melatonin［J］. Neurogastroenterol Motil，2010，22(12):e364-e373.

［15］ Matheus N，Mendoza C，Iceta R，et al. Melatonin inhibits serotonin transporter activity in intestinal epithelial cells［J］. J Pineal Res，2010，48(4):332-339.

［16］ Cuzzocrea S，Mazzon E，Serraino I，et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis［J］. J Pineal Res，2001，30(1):1-12.

［17］ Chan HC，Lui KM，Wong WS，et al. Effect of melatonin on chloride secretion by human colonic T84 cells［J］. Life Sci，1998，62(23):2151-2158.

［18］ Mrnka L，Hock M，Rybová M，et al. Melatonin inhibits prostaglandin E2-and sodium nitroprusside-induced ion secretion in rat distal colon［J］. Eur J Pharmacol，2008，581(1-2):164-170.

［19］ Thor PJ，Krolczyk G，Gil K，et al. Melatonin and serotonin effects on gastrointestinal motility［J］. J Physiol Pharmacol，2007，58 Suppl 6:97-103.

［20］ Saha L，Malhotra S，Rana S，et al. A preliminary study of melatonin in irritable bowel syndrome［J］. J Clin Gastroenterol，2007，41(1):29-32.

［21］ Mickle A，Sood M，Zhang Z，et al. Antinociceptive effects of melatonin in a rat model of post-inflammatory visceral hyperalgesia:a centrally mediated process［J］. Pain，2010，149(3):555-564.