陳 曦 侯玉澤 蔡齊超 胡驍飛 鄧瑞廣 (河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471003)

黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)是黃曲霉毒素的一種，是在動(dòng)物攝入含有黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的飼料后，AFB1 在體內(nèi)經(jīng)羥基化所形成的代謝物。AFM1 主要存在于動(dòng)物的乳汁中，在肝腎、肉、蛋以及尿液也有存在。隨著人們生活水平的提高，乳及乳制品以其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。近年來(lái)，由于“蒙牛問(wèn)題奶”、“光明奶粉碘超標(biāo)”等食品安全事件的發(fā)生，AFM1 的污染問(wèn)題引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注［1］。目前，黃曲霉毒素M1 快速靈敏的免疫學(xué)檢測(cè)方法已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

1 黃曲霉毒素M1 概述

AFM1 屬于黃曲霉毒素的一種，其基本結(jié)構(gòu)為一個(gè)二呋喃環(huán)的氧雜萘鄰?fù)埸c(diǎn)299 ℃，形狀為長(zhǎng)方形片狀，無(wú)色結(jié)晶，且可溶于多種有機(jī)溶劑，如氯仿、乙腈和甲醇等［2，3］。黃曲霉毒素M1 在365 nm的紫外線(xiàn)下可發(fā)出藍(lán)紫色的熒光［4］。

黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)致癌物之一，它的毒性高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥的毒性，是氰化鉀的5 倍，砒霜的40 倍［5-7］。哺乳動(dòng)物攝入被AFB1污染的食品或飼料之后，在體內(nèi)肝微粒體單氧化酶的催化下，通過(guò)細(xì)胞色素P450 的調(diào)節(jié)作用，末端呋喃環(huán)C-10 被羥基化就生成了AFM1［9］。研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)和乳牛攝入AFB1 后，在其乳汁中變成AFM1的轉(zhuǎn)化率為0.3%～6.1%［10］。AFM1 毒性主要表現(xiàn)在致癌性和致突變性，對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。陳振元［11］、鄔少明［12］、涂文升［13］等研究人員通過(guò)對(duì)啟東、扶綏等肝癌高發(fā)區(qū)的研究，發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)病率與AFB1的攝入以及轉(zhuǎn)化為AFM1 的轉(zhuǎn)化率有密切關(guān)系。

近年來(lái)，AFM1 在乳及乳制品中的污染現(xiàn)象十分普遍。Rahimi 等［14］調(diào)查了150 份伊朗農(nóng)場(chǎng)的乳樣，其中包括60 份牛乳，42 份綿羊乳和48 份山羊乳。在分析的樣品中，黃曲霉毒素M1 檢出的概率是46.7%，平均濃度是(40.35±22.2)ng/L。在受污染的樣品中，有37.5%的牛乳和5.9%的山羊乳中黃曲霉毒素M1 的含量高于50 ng/L。Zinedine等［15］用免疫親和柱-熒光色譜法檢測(cè)來(lái)自摩洛哥五個(gè)不同的生產(chǎn)乳制品的公司的54 個(gè)樣品中的黃曲霉毒素M1 的含量。分析結(jié)果表明，在摩洛哥的受檢樣品中，88.8%的受檢樣本都受到了AFM1 污染，僅7.4%的受檢樣本低于0.05 μg/L。Dutton 等［16］分別對(duì)南非的九家奶牛場(chǎng)的生乳及成品牛乳進(jìn)行了抽樣，結(jié)果所有生乳均檢出了黃曲霉毒素M1，絕大部分的成品牛乳中黃曲霉毒素M1 的含量超過(guò)0.05 μg/L。針對(duì)食品中AFM1 的污染問(wèn)題及其強(qiáng)烈的毒性作用，部分國(guó)家和地區(qū)都制定了乳制品中AFM1 的限量標(biāo)準(zhǔn)(表1)，其中歐盟和日本對(duì)乳制品中AFM1 的限量標(biāo)準(zhǔn)要求最為嚴(yán)格。

表1 部分國(guó)家和地區(qū)AFM1 的限量標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Permissible limit of AFM1 in some countries and regions

為避免食品中AFM1 的污染對(duì)人體健康造成危害，針對(duì)食品中AFM1 的定性定量檢測(cè)方法就顯得尤為重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法有薄層層析色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。但是由于TLC 只能定性不能定量，而且所需時(shí)間長(zhǎng);HPLC 樣品處理過(guò)程較為繁瑣，儀器昂貴。所以，這兩種方法在實(shí)際應(yīng)用中都無(wú)法進(jìn)行大范圍推廣?；诳乖贵w反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏性好、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模檢測(cè)，能夠得到很好的推廣。近年來(lái)，隨著學(xué)科間的相互滲透，免疫學(xué)檢測(cè)方法涉及的范圍不斷擴(kuò)大，新的免疫學(xué)檢測(cè)方法層出不窮。

2 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法

自1971 年Engvall［19］將ELISA 用于IgG 定量測(cè)定，使得酶標(biāo)抗體技術(shù)逐步發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。酶聯(lián)免疫吸附法的原理是將抗體或完全抗原包被在固相載體上，測(cè)定時(shí)將待測(cè)樣品和酶標(biāo)抗原或抗體的混合物與固相載體表面吸附的抗體或抗原反應(yīng)，再洗滌去除抗原抗體復(fù)合物或游離成分，然后加入酶作用底物，催化顯色，最后加終止液終止反應(yīng)［20，21］。ELISA 方法具有快速簡(jiǎn)便、特異性高、敏感性強(qiáng)、無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備且對(duì)樣品的純度要求不高等優(yōu)點(diǎn)，特別適應(yīng)于大批樣品的檢測(cè)，在AFM1 的快速檢測(cè)上有較高的應(yīng)用價(jià)值。由于該方法對(duì)樣品純度要求不高，所以在試驗(yàn)中易產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象，且受外在環(huán)境影響較大。

裴世春等［22］采用牛血清白蛋白與AFM1 偶聯(lián)，制備人工抗原免疫BALB/c 小鼠，獲得了特具有靈敏性高、特異性強(qiáng)的單克隆抗體，并利用此抗體建立間接競(jìng)爭(zhēng)定量ELISA 方法，該方法的最低檢出限是0.08 ng/ml，校正曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍為0.04～5 ng/ml。Laura 等［23］發(fā)現(xiàn)了一種可半定量測(cè)定AFM1 的側(cè)流裝置，具有較高的靈敏度，最低檢測(cè)限量為20 ng/L。Zhang 等［24］利用兩步篩選法篩選出5 株具有抗黃曲霉毒素且親和力高的通用細(xì)胞株，其中ICII細(xì)胞株親和力最好，靈敏度最高，對(duì)AFM1 的最低檢出限為13.2 pg/ml。Guan 等［25］利用半固體篩選法，篩選出抗AFM1 的細(xì)胞株，該細(xì)胞株的親和力達(dá)到1.74×109L/mol 且與黃曲霉毒素B1、B2、G1 和G2 都無(wú)交叉反應(yīng)，利用此抗體建立了超靈敏的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法，可檢測(cè)牛奶及嬰幼兒乳制品，檢測(cè)限分別為3 和6 ng/L，將該方法應(yīng)用于樣品中檢測(cè)，回收率在91%～110% 之間，變異系數(shù)小于10%，與標(biāo)準(zhǔn)的HPLC 比較，具有非常好的相關(guān)性。

3 電化學(xué)免疫傳感器法

電化學(xué)免疫傳感器是將高靈敏的傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，用以監(jiān)測(cè)抗原抗體反應(yīng)的生物傳感器，具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用在臨床各個(gè)領(lǐng)域［26］。電化學(xué)免疫傳感器主要有競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)兩種模式來(lái)檢測(cè)黃曲霉毒素。

競(jìng)爭(zhēng)模式是將特異性的抗體或抗原-蛋白復(fù)合物固定在探針上。在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中，游離的酶-目標(biāo)物復(fù)合物與目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合探針上的抗體或抗原。最后根據(jù)酶催化氧化底物所產(chǎn)生電流的多少進(jìn)行定量。Micheli 等［27］研制出AFM1 的檢測(cè)探針，并對(duì)pH 值、每一個(gè)步驟的時(shí)間、溫度的長(zhǎng)度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得出AFM1 的最低檢測(cè)限為25ppt。并與色譜法進(jìn)行比較，得出電化學(xué)法具有更好的檢測(cè)限和更短的分析時(shí)間。

非競(jìng)爭(zhēng)模式是通過(guò)抗體—抗原復(fù)合物一步式免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)?？乖c抗體一酶復(fù)合物的結(jié)合，對(duì)電子探針產(chǎn)生阻礙導(dǎo)致電流發(fā)生變化。Parker 等［28］采用這種方法，測(cè)定牛奶中AFM1 的含量，得出的AFM1的檢測(cè)范圍為39～1 000 ng/L。與高效液相檢測(cè)方法相比，靈敏度上是可以相媲美的，在便攜性和成本上卻是大大優(yōu)于后者。Dinckaya 等［29］創(chuàng)建了一個(gè)檢測(cè)黃曲霉毒素M1 的新的免疫傳感器，以金納米粒子為金電極，搭配半胱胺的單層膜，再加上探測(cè)器，組裝成新的免疫傳感器。該傳感器檢測(cè)黃曲霉毒素M1的范圍為1～14 ng/ml，偏差為0.36 ng/ml。

4 免疫熒光法

免疫熒光技術(shù)就是將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素或有熒光的物質(zhì)制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。然后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量［30］。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍寬、分析速度快、標(biāo)記物制備較簡(jiǎn)便、有效使用期長(zhǎng)、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。該方法一般與免疫層析配合使用，但是樣品處理完全依賴(lài)免疫親和柱，樣品的提取液未經(jīng)色譜柱分離，遇到復(fù)雜的基質(zhì)樣品或共存干擾物，可能會(huì)帶來(lái)結(jié)果偏差。

王偉等［31］用熒光光度法測(cè)定高乳脂乳和乳制品中的黃曲霉毒素M1，該方法的檢測(cè)限為0.1 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，回收率88%～93%。已經(jīng)能夠滿(mǎn)足對(duì)進(jìn)出口乳及乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)。Beloglazova 等［32］用熒光標(biāo)記技術(shù)定量測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1，得到的最低檢測(cè)限是0.014 μg/kg。而且假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的比率分別為2.6%和3.3%，均低于5%。

5 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析技術(shù)就是利用膠體金本身的顯色特點(diǎn)結(jié)合免疫層析技術(shù)診斷特異性的待測(cè)物而發(fā)展起來(lái)的［33］。它在對(duì)樣品的檢測(cè)過(guò)程中，既不需要對(duì)樣品進(jìn)行分離純化，也不需對(duì)樣品檢測(cè)溶劑做任何的前處理，方便、快捷。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于研制各種膠體金免疫層析試紙條和試劑盒。但是，膠體金免疫層析試紙條和試劑盒一般保存時(shí)間有限，在常溫下不能長(zhǎng)久保存。

Wang 等［34］研制出一種用于檢測(cè)乳及乳制品中AFM1 的納米金免疫層析試紙條。在檢測(cè)的15 種乳及乳制品中，有6 種乳及乳制品存在輕微的AFM1 污染，所有乳及乳制品中AFM1 均低于1 ng/ml。該試紙條的檢測(cè)限為0.028 ng/ml，檢測(cè)時(shí)間為10 min。孫翠萍等［35］利用膠體金免疫層析技術(shù)研制了一種快速檢測(cè)牛奶中的AFM1 試紙條，經(jīng)過(guò)測(cè)試，該試紙條的檢測(cè)限為0.5 ng/ml，檢測(cè)時(shí)間為10 min，假陽(yáng)性率和假陰性率均為0，該方法準(zhǔn)確，可靠，使用簡(jiǎn)便，適合大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

6 無(wú)毒檢測(cè)法

在AFM1 檢測(cè)過(guò)程中，必不可少的要使用到AFM1 標(biāo)準(zhǔn)品，而AFM1 毒性較強(qiáng)，很可能對(duì)實(shí)驗(yàn)人員以及環(huán)境造成危害，但是，噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)可能為我們打開(kāi)了另一扇門(mén)。噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA 序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)［36］。熊?chē)[等［37］以抗AFM1 的單克隆抗體為篩選配基，經(jīng)過(guò)淘選，從噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)中篩選獲得了與抗AFM1 單克隆抗體具有較高親和性的陽(yáng)性噬菌體克隆。也即是說(shuō)，模擬的表位肽能夠取代AFM1 進(jìn)行反應(yīng)，不僅保護(hù)了實(shí)驗(yàn)人員的健康，并且還能減少對(duì)環(huán)境的污染。

7 問(wèn)題與展望

隨著人們生活水平的日益提高，食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到重視，解決AFM1 可能造成的污染問(wèn)題迫在眉睫，因此，針對(duì)AFM1 檢測(cè)方法的研究就顯得尤為重要。TLC 只能定性不能定量，且耗時(shí)長(zhǎng);HPLC 操作繁瑣，儀器昂貴，且需要專(zhuān)業(yè)的人才，而免疫學(xué)檢測(cè)方法因其操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，且靈敏度高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。ELISA 方法大大提高了AFM1 的檢測(cè)效率，電化學(xué)免疫傳感器法則是在ELISA 方法的基礎(chǔ)上從技術(shù)上提高了檢測(cè)AFM1 的靈敏度，免疫熒光法是在電化學(xué)免疫傳感器法下加入熒光標(biāo)記物，擴(kuò)大了檢測(cè)AFM1 的范圍。膠體金免疫層析法就是在免疫熒光法的啟發(fā)下，利用膠體金本身的顯色特點(diǎn)結(jié)合ELISA 方法，使檢測(cè)極限顯著提高得同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間。而應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選毒素模擬表位肽，可減少AFM1 測(cè)定中所使用的AFM1 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)試驗(yàn)人員及環(huán)境的危害。因此，把ELISA 技術(shù)與膠體金技術(shù)及噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，用于測(cè)定各種對(duì)人類(lèi)及環(huán)境可能有毒害作用的物質(zhì)，必將成為一種趨勢(shì)，且擁有十分廣闊的前景。

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