黃剛哲 金勇男 (延邊大學附屬醫(yī)院老年病科，延吉 133000)

風濕性心臟病(RHD)是由甲組乙型溶血性鏈球菌感染引起變態(tài)反應(風濕熱)的后遺癥，屬自身免疫性疾?。?］。常見發(fā)生病理變化的部位是心臟瓣膜，二尖瓣為最常見受累部位［2］。TGF-β1 通過自身信號通路的調節(jié)能夠影響多種生命活動，包括細胞生長、增殖、凋亡等。IL-10 是近幾年新發(fā)現的細胞因子，具有抑制多種炎性分子及自身抗體合成的功效。TGF-β1 信號通路通過促進上皮間質轉化，調控基因的表達，從而發(fā)揮生物學效應。我們通過篩選發(fā)現血清IL-10、TGF-β1 濃度與風濕性心臟病患者瓣膜組織自身抗原間可能存在異常關系。我們通過構建噬菌體展示文庫篩選自身抗原的異常表達，并通過一系列外周血標志性物質比例和濃度的比較，分析其與RHD 之間存在的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選取2008 年到2013 年我院心內科收治的通過24 h 動態(tài)心電圖及超聲心動圖檢測確診為風濕性心臟病的63 例患者作為實驗組，NY-HA 評級2～4 級，實驗組患者共計63 例，其中男性27 例，平均年齡(48.2±11.3)歲;女性36 例，平均年齡(52.1±9.8)歲。對照組患者為我院體檢中心隨機篩選出來的63 位健康志愿者，其中男性27 例，平均年齡(48.2±10.4)歲;女性36 例，平均年齡(52.1±8.9)歲。實驗組和對照組在年齡、性別等中無統(tǒng)計學意義，具有可比性。實驗開始前對實驗組和對照組患者均進行提前告知并進行相關介紹，征得患者及家屬同意后開始試驗。納入標準:經冠脈CT、X 光透視和肝功腎功檢測、癌胚檢測、血常規(guī)檢查排除存在冠心病、肺功能異常、肝腎功能不全、腫瘤、其他炎性感染性疾病和糖尿病、甲亢甲減等內分泌疾病的存在。詢問近期藥物使用情況，確定患者無服用免疫調節(jié)劑。詢問病史，確定一月內無其他自身免疫性疾病的發(fā)生。

排除標準:排除存在冠狀動脈異常，肝、腎功能異常、存在惡性腫瘤及存在感染性和內分泌系統(tǒng)疾病的患者，對使用影響試驗的藥物的患者和存在其他自身免疫性疾病的患者，向患者和家屬解釋清楚后，排除出實驗組。

1.1.2 主要材料及試劑 實驗組及對照組均取抗凝血標本5 ml×2 管，上海研晶生化試劑有限公司生產的鼠抗人CD4-FITC 熒光抗體(克隆:mPC-13);武漢科昊佳生物科技有限公司生產的鼠抗人CD25-PE(克隆:mPC-19);上海北諾生物科技有限公司分裝的eBioscince 公司生產的Anti-Human Foxp3 APC 100 testsebioscience 試劑盒。安迪生物科技(上海)有限公司銷售的R＆D IL-10 和TGF-β1 酶聯免疫試劑盒。北京索萊寶科技有限公司生產的R1200 總RNA 提取試劑盒;北京雅安達生物技術有限公司生產的RNeasy Plus Mini Kit(250)74136 qiagen 試劑盒;Clontech 公司生產的SMARTTMcDNA Library Construction Kit 試劑盒以及馬克西姆公司生產的PCR 反應試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 患者心肌組織噬菌體展示文庫的構建與自身抗原RHDAG1 的獲得與鑒定 兩組間所有對象均取新鮮心耳組織保存于樣本保護液中，液氮下手工研缽制備組織勻漿，進行心肌組織總RNA 提取。參照SMARTTMcDNA Library Construction Kit 試劑盒構建心肌組織噬菌體展示文庫［3］。對文庫進行包裝和鑒定后進行文庫免疫篩選，并對自身抗原編碼基因進行分析，確定相關自身免疫抗原。對自身抗原基因表達載體進行構建并進行體外表達和免疫性試驗。

1.2.2 血樣標本的處理及使用 實驗組及對照組的5 ml×2 管抗凝血標本，一管5 000 r/min×3 min離心后取血清進行酶聯免疫吸附法進行對IL-10、TGF-β1 血清濃度的檢測。另一管進行外周血單核細胞(PBMC)的分離。將樣本細胞濃度稀釋至106級別/ml。取樣20 μl 加入相關試劑盒，再分別取CD4-FITC 25 μl、CD25-PE 25 μl 加入，37℃避光保存30 min，5 000 r/min×3 min 離心棄上清。加入試劑盒相應固定一裂解液3 ml 37℃避光反應30 min。反應完畢后加入Foxp3-APC 30 μl 37℃避光反應30 min，PBS 洗滌、離心，使用流式細胞檢測儀檢測，CD4 設門，分析相應CD4+CD25+Foxp3+亞群，每份標記1 萬個細胞，以CD4+CD25+Foxp3+-Treg/CD4+T淋巴細胞的比例表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 樣本資料采用PEMS 3.1 軟件處理。資料采用t 檢驗，以P＜0.05 具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 具有顯著意義。

2 結果

2.1 對RHD 患者瓣膜組織自身抗原變化的比較將文庫制成雙層瓊脂板，37℃恒溫培養(yǎng)4.5 h，10 mmol/L IPTG 潤洗覆蓋培養(yǎng)6 h，標記后取膜，脫脂奶粉4℃封閉培養(yǎng)10 h，抗血清37℃雜交結合2 h后洗膜3 次，多次雜交后選取陽性板繼續(xù)篩選，經多次篩選得出三種疑似與RHD 相關的瓣膜組織自身抗原，分別是THYN1V1、THYN1V2、RHDAG1 三種，通過與對照組患者的比較，發(fā)現RHDAG1 與對照組間具有明顯的差異，且將體外表達的RHDAG1 與3例風濕熱患者、5 例RHD 患者和5 例健康志愿者的血清分別進行結合反應試驗，發(fā)現RHDAG1 與風濕熱和RHD 患者血清出現結合，與健康志愿者血清不結合，這提示RHDAG1 可能與風濕熱及風濕性心臟病的發(fā)展有關，結果見表1。

2.2 兩組間外周血調節(jié)性T 細胞比例的比較 我們對兩組實驗對象的血樣處理后，使用流式細胞檢測儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T 細胞的比例并進行比較，提示RHD 患者血清Treg 比例低于對照組的相關數據，具有統(tǒng)計學差異。結果見表2。

2.2 兩組間IL-10、TGF-β1 血清濃度的比較 我們對血樣離心后取血清酶聯免疫吸附法檢測IL-10、TGF-β1 血清濃度，結果顯示TGF-β1 的上升可以使Treg 中Foxp3 表達出現上升，使CD4+CD25+Foxp3+細胞數量上升，兩組間IL-10、TGF-β1 血清濃度的比較具有差異性，CD4+CD25+Foxp3+T 細胞與IL-10、TGF-β1 的變化正相關。結果見表3。

表1 瓣膜組織自身抗原變化的比較Tab.1 Comparison of valvular tissue autoantigen changes

表2 兩組間外周血調節(jié)性T 細胞比例的比較Tab.2 Comparison peripheral regulatory T cell percentage of between two groups

表3 兩組間IL-10、TGF-β1 血清濃度的比較Tab.3 Comparison of IL-10，TGF-β1 serum concentration between two groups

3 討論

風濕性心臟病是一種最典型的人類自身免疫性疾病，因為人體心肌組織與甲組乙型溶血性鏈球菌表面抗原相似，在甲組乙型溶血性鏈球菌感染后機體產生相應抗體，誘發(fā)免疫反應，在甲組乙型溶血性鏈球菌被消滅后繼續(xù)與人體組織蛋白產生交叉識別，導致人體免疫系統(tǒng)出現識別錯誤進而導致自身免疫疾病的發(fā)生。甲組乙型溶血性鏈球菌細胞壁表面含有多糖及多種表面蛋白(M、T、R 等)［4］。在人體組織中諸如心肌球蛋白、原肌球蛋白以及多種瓣膜蛋白上均有M 蛋白的身影，M 蛋白作為甲組乙型溶血性鏈球菌最重要的抗原結構，由于與體內多種表面蛋白的交叉，構成了人體對鏈球菌耐受和自身免疫反應的分子基礎。

我們通過尋找能夠引起RHD 發(fā)生自身免疫反應的抗原，希望能為RHD 的研究找到一條新路。通過構建心肌組織噬菌體展示文庫，對文庫進行鑒定和免疫篩選，并對自身抗原編碼基因進行分析，最終確定三組疑似與RHD 相關的瓣膜組織自身抗原，分別是THYN1V1、THYN1V2、RHDAG1 三種，通過與對照組患者的比較，發(fā)現RHDAG1 與對照組間具有明顯的差異。將在體外通過質粒轉錄表達的RHDAG1 與3 例風濕熱患者、5 例RHD 患者和5 例健康志愿者的血清分別進行結合反應試驗，發(fā)現RHDAG1 與風濕熱和RHD 患者血清出現結合，與健康志愿者血清不結合，這提示RHDAG1 可能與風濕熱及風濕性心臟病的發(fā)展有關。我們通過對組織展示文庫的構建和與相關樣本的血清進行結合反應闡釋了交叉抗原RHDAG1 與RHD 之間相關聯的直接證據。

各實驗樣本血樣經處理后使用流式細胞檢測儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T 細胞的比例，各組結果進行比較，提示RHD 患者血清Treg 比例低于對照組樣本中的相關數據，具有統(tǒng)計學差異。有研究顯示Treg 細胞有抑制自身免疫疾病發(fā)生的功效［5］。當CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T 細胞數量減少時，患者免疫功能下降，促使B 淋巴細胞產生一定數量的自身抗體，極易發(fā)生自身免疫性損傷。鑒于這種抗體會隨血液循環(huán)進行擴散，造成了無法清除和長時間持續(xù)存在的影響，容易引起疾病的復發(fā)［6］。通過臨床跟蹤我們也可發(fā)現，RHD 患者體內Treg 細胞低于正常水平，且大部分患者病史長，出現病情反復，這也說明與抗體的無法清除和長時間持續(xù)有關。心肌組織通過長時間的抗擊自身抗體的攻擊，最終會導致瓣膜部位發(fā)生病變，導致嚴重的病理后果。

IL-10 是近幾年新發(fā)現的細胞因子，又稱細胞素合成抑制因子［7］。具有抑制多種炎性分子及自身抗體合成的功效［8］。轉化生長因子-β(TGF-β)目前共發(fā)現三種類型，分別為TGF-β1、TGF-β2 和TGFβ3。TGF-β1 由體內單核細胞、樹突狀細胞分泌，在RHD 中表達增強，提示可能與瓣膜纖維化有關［9］。TGF-β1 的上升可以使Treg 中Foxp3 表達升高，使CD4+CD25+Foxp3+細胞數量上升，這也印證了實驗中兩組間外周血調節(jié)性T 細胞比例較RHD 患者CD4+CD25+Foxp3+-Treg/CD4+T 細胞的比例明顯低于對照組健康志愿者的比例?？鼓獦吮倦x心后取血清進行ELISA，檢測IL-10、TGF-β1 血清濃度，結果顯示兩組間IL-10、TGF-β1 血清的濃度間的比較均具有明顯的差異性。

綜上所述，自身抗原RHDAG1 的表達對RHD的進展有一定作用，檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T 細胞的比例和IL-10、TGF-β1 血清濃度對于RHD 的診斷具有重要意義。

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