楊 嵐，郝永清，何 焱，潘海婷，許金朋，于自民

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是一種影響奶牛業(yè)發(fā)展的常見(jiàn)、多發(fā)疾病，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)公共衛(wèi)生和人類健康造成危害。奶牛乳房炎由多種微生物感染引起，其中最主要為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[1]。

S.aureus 的毒力因子主要有粘附素、莢膜多糖、毒素和酶[2]，其對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的粘附和定植被認(rèn)為是S.aureus 性乳房炎的致病機(jī)制之一[3]。在感染的早期，只有當(dāng)S.aureus 粘附到宿主細(xì)胞上時(shí)，莢膜和毒素才能開(kāi)始表達(dá)，因此粘附是感染的關(guān)鍵。范鑫等研究表明，粘附素的纖連素結(jié)合蛋白(FnBPs)和凝集因子A(ClfA)在研制S.aureus 性乳房炎疫苗時(shí)具有重要意義[4]。而CPs 能夠干擾中性粒細(xì)胞對(duì)S.aureus 的吞噬作用，逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)，導(dǎo)致S.aureus 易于感染乳腺組織[5]。研究表明，將免疫原性較好的FnBPB-ClfA 融合蛋白作為載體和CP 偶聯(lián)免疫小鼠可以產(chǎn)生良好的免疫效果[6]。

脂質(zhì)體(Liposome)、氫氧化鋁(ALUM)及大腸桿菌不耐熱腸毒素B(LTB)均為有效的疫苗佐劑[7-10]。關(guān)于針對(duì)奶牛S.aureus 毒力因子的疫苗研究大多只進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)將脂質(zhì)體包被的CP8-FnBPB-ClfA、ALUM 乳化的CP8-FnBPBClfA，及ALUM 乳化CP8-FnBPB-ClfA 后與LTB 混合分別免疫泌乳期奶牛，檢測(cè)免疫后不同期血清中IgG 和IgA、乳汁中IgG 含量、體細(xì)胞數(shù)(Somatic cell count，SCC)，以評(píng)價(jià)其對(duì)S.aureus 性奶牛乳房炎的免疫效果。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 牛源血清IgG ELISA 試劑盒、牛源血清IgA ELISA 試劑盒、牛源牛乳IgG ELISA試劑盒購(gòu)自R&D SYSTEMS 公司；SCC 檢測(cè)試劑盒及ADAM-SCC 檢測(cè)儀購(gòu)自Digital Bio Technology 公司；快速革蘭氏染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；24 頭健康的同齡(2 歲～3 歲)同胎次并且生產(chǎn)時(shí)間差30 d 以內(nèi)的泌乳期荷斯坦奶牛由內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣恩和牧場(chǎng)提供。

1.2 抗原的制備

1.2.1 CP8-FnBPB-ClfA 的制備 按照文獻(xiàn)[6]的方法，將已純化濃度為72.94 %的CP8 通過(guò)EDC 法與FnBPB-ClfA 偶聯(lián)，制備CP8-FnBPB-ClfA 偶聯(lián)物，使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度至0.81 mg/mL 進(jìn)行免疫抗原的制備。

1.2.2 脂質(zhì)體佐劑抗原的制備 將卵磷脂、膽固醇和磷脂酰乙醇胺按質(zhì)量比7∶3∶2 溶于體積比為2∶1 的三氯乙烷、甲醇混合溶液中，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，45 ℃水浴后抽真空干燥。將干燥后所得磷脂片層每100 mg 加入5 mL CP8-FnBPB-ClfA，振蕩混勻，制成脂質(zhì)體佐劑抗原。

1.2.3 ALUM 佐劑抗原的制備 250 mL 5%Al2(SO4)3溶液與100 mL 5 % NaOH 溶液混合，強(qiáng)烈攪拌，生理鹽水離心洗滌沉淀2 次，在沉淀中再次加入20 mL生理鹽水，使沉淀懸浮成為懸濁液，即得ALUM 佐劑，將其與CP8-FnBPB-ClfA 1∶1(v/v)混合，使用漩渦混合器，以3 000 r/min 的速度振蕩30 min，充分混勻，即為ALUM 佐劑抗原。

1.2.4 LTB 佐劑抗原的制備 將LTB 與1.2.3 中ALUM 乳化抗原直接混合，使LTB 終濃度為40μg/mL，制成LTB 佐劑抗原。

1.3 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 30 頭奶牛隨機(jī)分為5組，分組及處理情況見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫分組Table 1 Immunization groups of laboratory animals

用不同佐劑抗原進(jìn)行免疫接種，采取臀部肌肉注射方式，每21 d 免疫一次，共免疫3 次。免疫劑量以抗原量計(jì)算，5 mg/頭。

1.4 牛乳中SCC測(cè)定 采集各時(shí)段乳汁樣品，采樣時(shí)棄前3 把乳，每天每次分別在早、中、晚采集，將這3 次取得的乳汁樣品均勻混合，吸取中間液面的混合乳汁樣品100 μL，與染液1∶1(v/v)混合，上下顛倒混勻，吸取10 μL 至SCC 檢測(cè)芯片孔道，通過(guò)SCC 計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 牛血清中CP8-FnBPB-ClfA抗體水平測(cè)定采用ELISA 法對(duì)牛血清中CP8-FnBPB-ClfA 抗體進(jìn)行測(cè)定。以CP8-FnBPB-ClfA 包被酶標(biāo)板，分別以免疫牛和對(duì)照牛的待測(cè)血清為一抗，兔抗牛IgG-HRP為二抗(1∶2 000)，TMB 顯色，測(cè)定OD490nm值。

1.6 牛血清中總IgG、IgA含量及牛乳中IgG含量測(cè)定 使用牛源血清IgG ELISA 試劑盒和牛源血清IgA ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中的IgG、IgA 含量，采用牛源牛乳IgG ELISA 試劑盒檢測(cè)牛乳中的IgG 含量，試驗(yàn)步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用SAS 9.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SAS Institute Inc，Cary，NC)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 牛乳中SCC測(cè)定 使用SCC 計(jì)數(shù)儀對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組免疫前后不同時(shí)間乳汁樣品中的SCC 進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，各免疫組奶牛乳汁中SCC 保持穩(wěn)定，低于50 萬(wàn)個(gè)/mL，與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)，而對(duì)照組SCC 呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)，均高于50萬(wàn)個(gè)/mL，伴有患乳房炎的可能；在免疫期間，3、4 組奶牛乳汁中的SCC 低于1、2 組，與之相比差異顯著(p<0.05)，但3、4 組間差異不顯著(p>0.05)(圖1)。

圖1 免疫期內(nèi)SCC 數(shù)動(dòng)態(tài)變化Fig.1 The dynamic changes of SCC in immunity period milk

2.2 牛血清中CP8-FnBPB-ClfA抗體測(cè)定 采用間接ELISA 法，分別對(duì)免疫組及對(duì)照組牛血清進(jìn)行CP8-FnBPB-ClfA 抗體測(cè)定。結(jié)果顯示，免疫14 d后，各免疫組奶牛血清中CP8-FnBPB-ClfA 抗體水平升高，與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)；2 組抗體水平升高，與其他各免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，但其水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降；免疫21 d 后，3、4組抗體水平高于其他各免疫組，與各免疫組相比差異顯著(p<0.05)，3、4 組間差異不顯著(p>0.05)(圖2)。

2.3 牛血清中IgG及IgA含量測(cè)定 使用牛源IgG ELISA 試劑盒和牛源IgA ELISA 試劑盒對(duì)各組奶牛血清中的IgG 及IgA 含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，免疫14 d 后，各免疫組奶牛血清中IgG 及IgA 水平升高，與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)；2 組中IgG及IgA 含量升高，與其他免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，但其含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；免疫21 d后3、4 組奶牛血清中IgG 及IgA 水平高于其他各免疫組，與各免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，3、4組間差異不顯著(p>0.05)(圖3)。

圖2 免疫期內(nèi)牛血清中CP8-FnBPB-ClfA 抗體測(cè)定結(jié)果Fig.2 The results of test CP8-FnBPB-ClfA antibody in immunity period in bovine serum

圖3 奶牛血清中IgG(A)及IgA(B)含量測(cè)定結(jié)果Fig.3 Test results of bovine IgG(A)and IgA(B)concentration in serum

2.4 牛乳中IgG含量測(cè)定 使用牛源IgG ELISA 試劑盒對(duì)各組奶牛乳中的IgG 含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，免疫14 d 后，各免疫組奶牛乳汁中IgG 水平升高，與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)；2 組乳汁中IgG 水平升高，與其他免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，但其含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；免疫21 d 后3、4組乳汁中IgG 水平高于其他各免疫組，與各免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，3、4 組間差異不顯著(p>0.05)(圖4)。

3 討論

圖4 奶牛乳中IgG 含量測(cè)定結(jié)果Fig.4 Test results of bovine IgG concentration in milk

SCC 主要來(lái)自于血液的白細(xì)胞(Leucocytes)，可分為淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞兩種[11]。由于乳中的白細(xì)胞具有抵御外界微生物感染的作用，因此在細(xì)菌入侵乳房后，白細(xì)胞通過(guò)毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙遷移至炎癥組織，白細(xì)胞數(shù)量升高，該乳區(qū)的SCC 也隨即增多[12]。許多國(guó)家均將SCC 作為衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)。通常，國(guó)際上規(guī)定以SCC 每毫升50 萬(wàn)為界定乳房炎的標(biāo)準(zhǔn)[13]。因此，SCC 可以作為監(jiān)測(cè)奶牛乳房炎的可靠指標(biāo)之一。

將包含F(xiàn)nbp 和ClfA 的DNA 疫苗免疫乳腺已感染S.aureus 的奶牛，能夠產(chǎn)生針對(duì)Fnbp 和ClfA 的抗體[14]。用CP5 免疫奶牛，可以產(chǎn)生持久的免疫學(xué)反應(yīng)[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用CP8-FnBPB-ClfA 免疫泌乳期奶牛具有可行性。

經(jīng)本研究證明，用CP8-FnBPB-ClfA 或CP8-FnBPB-ClfA 與不同佐劑混合免疫泌乳期奶牛，在免疫期內(nèi)，能夠有效降低奶牛乳汁中的SCC 至正常水平，或使SCC 基本維持在正常范圍內(nèi)不變，在一定程度上預(yù)防和治療S.aureus 性奶牛乳房炎，改善牛乳品質(zhì)，提高牛乳質(zhì)量。抗體含量是評(píng)價(jià)體液免疫效果的關(guān)鍵指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)間接ELISA 及雙抗體夾心ELISA 法，對(duì)奶牛血清及乳汁中的抗體水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，以ALUM 佐劑乳化的CP8-FnBPB-ClfA 或ALUM 佐劑乳化的CP8-FnBPB-ClfA與LTB 混合后免疫泌乳期奶牛時(shí)，血清及乳汁中的抗體水平最高，持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)；但ALUM 佐劑乳化抗原是否與LTB 混合，免疫效果差異不顯著(p>0.05)。以上結(jié)果表明，CP8-FnBPB-ClfA 經(jīng)ALUM 佐劑乳化免疫奶牛，可提高機(jī)體抗體水平，誘導(dǎo)奶牛的體液免疫反應(yīng)，因此ALUM 佐劑乳化的CP8-FnBPB-ClfA有望用于S.aureus 性奶牛乳房炎亞單位疫苗的進(jìn)一步研究，為S.aureus 性奶牛乳房炎的免疫防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Naidu A S,Forsgren A.Comparison between lactoferin and subepothelial matrix protein binding in Staphylococcus aureus associated with bovine mastitis[J].Dairy Sci,1991,74:3353.

[2]Brouillette E,Talbot B G,Malouin F.The fibronectin-binding proteins of Staphylococcus aureus may promote mammary gland colonization in a lactating mouse model of mastitis[J].Infect Immun,2003,71:2292-2295.

[3]Sinha B,Fraunholz M.Staphylococcus aureus host cell invasion and post-invasion events[J].Int J Med Microbiol,2010,300(2-3):170-175.

[4]Fan Xin,Hao Yong-qing,Zhang Ai-rong,et al.Construction and prokaryotic expression of the co-expression plasmid with FnBPB-CLFA gene encoding Staphylococcus aureus adhesion[J].Chi Vet Sci,2011,41(02):173-177.

[5]Foster T J.Immune evasion by Staphylococci[J].Nat Rev Microbiol,2005,3(12):948-958.

[6]Liu Xiu-li,Hao Yong-qing,Wang Shu-yi,et al.Assessment of immunogenicity of CP8,ClfA-FnBPB antigens[J].Am J Animal Vet Sci,2013,8(3):134-141.

[7]Alving C R.Liposomes as adjuvants for vaccines[R].Walter Reed Army Institute of Research Washington DC:1997.

[8]Gupta R K.Aluminum compounds as vaccines adjuvants[J].Adv Drug Deliv Rev,1998,32(3):155-172.

[9]Millar D G,Hirst T R,Snider D P.Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit is a more potent mucosal adjuvant than its closely related homologue,the B subunit of cholera toxin[J].Infect Immun,2001,69:3476-3482.

[10]李娜，周偉芳，劉慧敏，等.疫苗佐劑的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35(1)：81-86.

[11]Waage S,Mork T.Bacteria associated with clinical mastitis in dairy heifers[J].J Dairy Sci,1999,82:4712-4719.

[12]Marcus E,Kehrli J R.Factor affecting milk somatic cell and their role in health of the bovine mammary gland[J].Dairy Sci,1994,77:619-627.

[13]William J M,David M,Alan K.Influence of somatic cell count and storage interval on composition and processing characteristics of milk from cows in late lactation[J].Aust J Dairy Technol,2001,56:213-218.

[14]郝建國(guó)，梁淑萍.日本學(xué)者對(duì)體細(xì)胞數(shù)與乳房炎關(guān)系的論述[J].中國(guó)奶牛，2002，1：52-54.

[15]Tollersrud T,Zernichow L.Staphylococcus aureus capsular polysaccharide type 5 conjugate and whole cell vaccines stimulate antibody responses in cattle[J].Vaccine,2001,19:3896-3903.