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短篇論著

可溶性NKG2D配體降低NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞殺傷功能的研究

韓文敏1, 賈祝霞1, 姜玉1, 朱志超2, 張修文2,

肖溶1, 楊建和1, 盧緒章1

(江蘇省常州市第二人民醫(yī)院, 1. 血液科; 2. 中心實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 常州, 213003)

關(guān)鍵詞:NKG2D配體; 自然殺傷細(xì)胞; 多發(fā)性骨髓瘤; 殺傷功能

人自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是人體抗腫瘤免疫的第一道防線，NK細(xì)胞通過識(shí)別自我的MHCⅠ類分子或Ⅰ類分子樣的獨(dú)特受體，可以識(shí)別和殺傷體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞[1-2]。體外實(shí)驗(yàn)[3-4]證實(shí)NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷能力，但是腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞可以逃逸免疫細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，而且通過NK細(xì)胞輸注治療骨髓瘤患者并沒有得到預(yù)期的效果，說明MM患者體內(nèi)環(huán)境抑制NK細(xì)胞功能。作者以前的研究[5-6]表明NKG2D介導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用，作者通過檢測(cè)MM患者血清中可溶性NKG2D配體水平變化，并通過細(xì)胞株模型探討可溶性的NKG2D配體對(duì)NK細(xì)胞抗骨髓瘤能力的影響。

1材料與方法

1.1　一般資料

選取2009年3月—2013年12月在本院確診的13例MM患者，中位年齡63歲(41～89歲)，所有患者均符合國(guó)內(nèi)MM診斷標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。以30名健康志愿者為正常對(duì)照，中位年齡59歲(45～82歲)，對(duì)照組均無腫瘤及自身免疫性疾病史。收集的血清放在-20 ℃凍存，然后統(tǒng)一檢測(cè)。

1.2　細(xì)胞及主要試劑

骨髓瘤細(xì)胞株U266由上海長(zhǎng)征醫(yī)院侯健教授惠贈(zèng)，用含有10%滅活胎小牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的PRMI1640培養(yǎng)液，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)抗體為美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品流式細(xì)胞抗體包括CD3-Percp、CD56-FITC、NKG2D-PE及NK細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)買于R&D Systems公司。用于sMICA、sMICB檢測(cè)的ELISA試劑盒購(gòu)于北京來博生物科技公司。Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)購(gòu)于Nunc公司。流式細(xì)胞儀(BD FACS Canto Ⅱ)為BD公司。

1.3　研究方法

1.3.1流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定：取待標(biāo)記的細(xì)胞1×105/100 mL，分別加入4 μL熒光抗體，4 ℃避光反應(yīng)30 min后用PBS洗2遍，用300 mL的PBS懸浮后上機(jī)檢測(cè)，每標(biāo)本記錄細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)。利用FlowJO 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.2ELISA檢測(cè)可溶性NKG2D配體水平：按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 mm處測(cè)定吸光度(A)值，并計(jì)算出待測(cè)標(biāo)本可溶性NKG2D配體(sMICA、sMICB)的表達(dá)水平。

1.3.3NK細(xì)胞分離和培養(yǎng)：將健康人單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌2次，按NK細(xì)胞分離試劑盒說明書進(jìn)行操作，分離純化的NK細(xì)胞用含有10%FBS、100 U/mL IL-2、50 U/mL青霉素、50 UG/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并檢測(cè)其表面NKG2D受體的表達(dá)水平。

1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn): Transwell上室加入2×105/200 mL的NK細(xì)胞懸液，對(duì)照組下室加入10%血清的1640培養(yǎng)液600 mL, 實(shí)驗(yàn)組下室加入2×105/600 mL的U266細(xì)胞。每組3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后檢測(cè)NK細(xì)胞表面NKG2D受體的表達(dá)或用作效應(yīng)細(xì)胞。

1.3.5NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)：根據(jù)作者以前應(yīng)用的方法[5]，骨髓瘤細(xì)胞U266預(yù)選用0.1 μM Calcein acetoxymethyl ester (CAM)孵育15 min后，標(biāo)定的U266用PBS洗2次，然后用培養(yǎng)液重新調(diào)整細(xì)胞濃度，并按照5×105/孔放到圓底的96孔板中，然后按照的E︰T比值為10加入NK細(xì)胞，在培養(yǎng)箱里一起孵育8 h后用PBS洗1次，然后用結(jié)合緩沖液重新混懸細(xì)胞，然后用加入7-AAD抗體在常溫中孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)特異性殺傷。特異性殺傷用百分比用公式：特異性殺傷(%)=(CT-TE/CT)×100% (CT表示在對(duì)照孔中活細(xì)胞的所占的比率，TE表示測(cè)試管中活細(xì)胞所占的比率)。

2結(jié)果

2.1　骨髓瘤患者血清可溶性NKG2D配體濃度

水平變化

比較健康人和初診的多發(fā)性骨髓瘤患者外周血清中可溶性NKG2D配體的濃度，ELISA方法檢測(cè)血清中NKG2D配體的濃度。多發(fā)性骨髓瘤患者外周血清中sMICA和sMICB的濃度分別是(156.4±47.1) ng/L和(106.2±35.3) ng/L，明顯高于正常人的(57.2±26.7) ng/L和(44.6±23.5) ng/L(P<0.001)。

2.2　骨髓瘤細(xì)胞U266培養(yǎng)上清中可溶性

NKG2D配體的濃度

U266細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后用ELISA檢查培養(yǎng)上清中NKG2D配體的濃度，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增多，骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中NKG2D配體的濃度逐漸增加。見表1。

表1　U266培養(yǎng)上清中sMICA和sMICB的表達(dá)水平　ng/L

2.3　可溶性NKG2D配體對(duì)NK細(xì)胞表面NKG2D受體及殺傷功能的影響

U266和NK細(xì)胞在Transwell共培養(yǎng)48 h檢測(cè)NK細(xì)胞表面NKG2D受體，實(shí)驗(yàn)組NK細(xì)胞表面的NKG2D受體表達(dá)為(66.5±5.8)%，明顯低于對(duì)照組的(96.8±7.4)%。作者用NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞U266為靶細(xì)胞，檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)U266特異性殺傷，實(shí)驗(yàn)組的NK細(xì)胞對(duì)U266特異性殺傷為(42.3±10.7)%，低于對(duì)照組的(62.8±15.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

人自然殺傷細(xì)胞是腫瘤生物治療常用的一類免疫細(xì)胞，NK細(xì)胞的殺傷活性是通過其表面的活化型受體介導(dǎo)的NK細(xì)胞激活[7-8]，其中NKG2D是NK細(xì)胞表面重要的活化型受體，它可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)的NKG2D配體從而殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)NK細(xì)胞活性的調(diào)控起重要作用[9-11]。但是腫瘤細(xì)胞的金屬蛋白酶可以水解細(xì)胞表面的NKG2D配體，從而形成可溶性NKG2D配體分子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃逸NK細(xì)胞識(shí)別和殺傷[12]。作者以前的研究表明患者的骨髓瘤細(xì)胞表面表達(dá)一定水平的NKG2D配體，免疫細(xì)胞通過NKG2D受體和配體的相互作用殺傷骨髓瘤細(xì)胞。作者進(jìn)一步檢測(cè)MM患者血清中可溶性NKG2D配體的濃度，發(fā)現(xiàn)MM患者血清中可溶性的NKG2D配體分子(sMICA，sMICB)明顯高于健康人(P<0.001), 可溶性NKG2D配體可能是體內(nèi)影響NK細(xì)胞功能的重要因素。

為了驗(yàn)證可溶性NKG2D配體對(duì)NK細(xì)胞功能的影響，作者以骨髓瘤細(xì)胞株U266為模型，驗(yàn)證骨髓瘤細(xì)胞分泌的可溶性NKG2D配體對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用的影響。作者以前的研究[13]發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞株U266表達(dá)一定水平的MICA/B蛋白分子，其培養(yǎng)上清可檢測(cè)到一定水平的sMICA/B，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其上清中sMICA/B濃度逐漸升高。作者用Tanswell共培養(yǎng)U266細(xì)胞和NK細(xì)胞48 h后可以發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞表面的NKG2D受體表達(dá)水平明顯下降，同時(shí)U266共培養(yǎng)的 NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞U266的殺傷作用明顯降低，這說明骨髓瘤細(xì)胞分泌的可溶性的NKG2D配體分子通過降低NK細(xì)胞表面的NKG2D受體表達(dá)，從而降低了NKG2D介導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用。

本研究表明，骨髓瘤細(xì)胞能夠分泌可溶性sMICA/B配體分子，降低NK細(xì)胞表面NKG2D受體的表達(dá)，從而導(dǎo)致了NK細(xì)胞抗腫瘤能力的下降，這可能是MM患者體內(nèi)NK細(xì)胞抗腫瘤能力下降的原因。改善腫瘤患者內(nèi)環(huán)境，降低體內(nèi)可溶性NKG2D配體分子水平，可能會(huì)改善體內(nèi)免疫細(xì)胞抗腫瘤能力，從而提高患者的無病生存時(shí)間及總生存時(shí)間。

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通信作者:盧緒章, E-mail: luxuzhang2008@163.com

基金項(xiàng)目:江蘇省常州市衛(wèi)生局重大科技項(xiàng)目(ZD201311)

收稿日期:2015-06-17

中圖分類號(hào):R 551.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)24-134-02

DOI:10.7619/jcmp.201524053