高湘湘，林 蘭，葛伯建

(南通大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇南通，226001)

原發(fā)性肺癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，2012中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒顯示肺癌死亡率占據(jù)惡性腫瘤死亡率的首位，達到45.57/10萬。其中，非小細胞肺癌(NSCLC)約占全部肺癌的80%。抑癌基因失活是肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟［1］。這些基因的異常改變，除與肺癌的發(fā)生有關(guān)外，還與其浸潤、轉(zhuǎn)移和復發(fā)有關(guān)，間接或直接地影響到肺癌的預后［2］。DLC-1基因，定位于第8號染色體短臂(8p21.3～22)。該基因為大鼠p122基因的人類同源基因，二者有92.5%相似性［3］。作者通過檢測DLC-1基因在早期肺癌組織中的表達狀況，并與肺癌患者臨床特征進行綜合分析，來探討DLC-1基因與肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院2012年6月—2014年1月經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)由病理科確診的肺癌患者72例，其中男45例，女27例，年齡56～79歲，平均61歲。以正常開胸取得的其他疾病患者的9例良性病變組織作為對照。患者取材前均未接受過放療和化療，肝、腎功能正常，排除孕婦、哺乳期婦女、精神疾病患者。每例肺癌標本均有癌旁正常組織作為對照。手術(shù)切除標本后立即置入液氮冷卻，再轉(zhuǎn)移至－70℃冰箱長期保存。

1.2 主要儀器

U-2001型紫外分光光度計定量(日本日立公司);德國 Biometra溫度梯度 PCR擴增儀;ECPS3000/150電泳儀;美國 BECKMAN AllegraTM RA 64R高速低溫離心機;美國BIO-RAD公司凝膠圖像分析儀。

1.3 總RNA的提取

對晚期肺癌組織、癌旁組織分別提取總RNA，紫外分光光度計定量?？俁NA的提取采用OMEGA RNA提取試劑盒提取，具體步驟參照說明書，提取的總RNA立即置于－70℃保存。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

對肺癌組織、癌旁組織和良性病變組織分別取3μg總RNA按照試劑盒反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄。B-actin作為內(nèi)參照，DLC-1基因及B-act in引物序列合成均由上海生工公司設(shè)計合成，DLC-1基因mRNA引物正義鏈:5'-GCTT GTGAT TGGCTACGG-3'反義鏈:5'-CCACCTCTTGCTGTCCCT-3'。B-actin mRNA引物(內(nèi)參)正義鏈:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'反義鏈:5'-GTT T TCT GC GCAAGT TAGG-3'。反應(yīng)條件為:預變性95℃ 5 min，94℃，30 s，溫度退火30 s，72℃1 min共35個循環(huán);72℃ 延伸10 min。取5μL擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照顯帶觀察DLC-1基因的表達狀況。

2 結(jié)果

2.1 DLC-1基因的表達狀況

60例肺癌標本中，22例表達陽性;與之相對應(yīng)的是癌旁組織49例表達陽性，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。9例良性病變組織中，有7例mRNA表達陽性，與肺癌組有顯著差異(P＜0.05)。見圖1。

圖1 DLC-1基因的表達狀況顯示

2.2 DLC-1基因的表達狀況與肺癌臨床特征的關(guān)系

60例肺癌組織中，DLC-1基因的表達狀況隨TNM分期及浸潤深度增加而下調(diào)明顯(P＜0.05)。見表1。

表1 DLC-1基因mRNA的表達水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

DLC-1基因當前被認為是一個新的抑癌基因，在正常組織中表達基本正常，但在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及等人類腫瘤中存在表達缺失現(xiàn)象［4－6］。通過 RT-PCR 方法對肺癌組織、癌旁組織和良性病變組織進行DLC-1基因擴增檢測，作者發(fā)現(xiàn)DLC-1基因的表達缺失與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。肺癌的癌旁組織標本中，DLC-1基因表達陽性率高達82%，而肺癌組織中僅為37%，二者差異顯著(P＜0.01)。9例良性病變組織中，有7例mRNA表達陽性，與肺癌組差異顯著(P ＜0.05)。Yuan等［7］研究結(jié)果與作者相近，他們報道在超過50%的原發(fā)性肝細胞癌組織及大多數(shù)細胞系中存在DLC-1基因的缺失，在28%的肝細胞系中檢測不到DLC基因的表達。本研究結(jié)果為DLC-1基因的低表達在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要作用提供了強有力的支持。

本研究將DLC-1基因mRNA的表達水平與肺癌患者臨床特征關(guān)聯(lián)后，作者發(fā)現(xiàn)DLC-1基因表達的缺失與腫瘤的分期顯著相關(guān)。對于分期為Ⅰ期的患者，表達陽性與陰性的比例相當，但是對于Ⅱ期和Ⅲ期患者，DLC-1基因表達缺失的比例明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義。

越來越多的研究［8－11］顯示，DLC-1 基因符合抑癌基因的標準。DLC-1定位于人類染色體8p21-22，這一區(qū)域在很多惡性腫瘤中經(jīng)常發(fā)生缺失，如腸癌、肝癌、前列腺癌等。所有這些證據(jù)表明，通過基因組表達缺失或者DNA甲基化，DLC-1可能是腫瘤細胞中基因表達失活的高發(fā)位點。Wilson等［12］在DLC基因上選取了3個微衛(wèi)星位點，對100例原發(fā)性肝癌組織進行了雜合性缺失分析，結(jié)果3個微衛(wèi)星位點的雜合性缺失率分別為44.3%、44.4%和50%，結(jié)果表明在原發(fā)性肝細胞癌中DLC-1等位基因的缺失為常見現(xiàn)象。

雖然已知DLC-1基因失活在肺癌發(fā)生中起著重要作用，但是目前尚未明確其具體的失活機制。迄今為止，在人類肝細胞癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了DLC-1基因的缺失，在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和前列腺癌中都發(fā)現(xiàn)了DLC-1啟動子區(qū)域的DNA甲基化異常［13］。DLC-1基因的點突變僅僅發(fā)生在幾種不同的實體腫瘤亞群中，表明點突變并不是肺癌中DLC-1基因失活的主要機制［14］。

［1］Bar J，Damianovich M，Hout Siloni G，et al.Genetic mutation screen in early non-small-cell lung cancer(NSCLC)specimens［J］.Clin Lung Cancer，2014，15(2):159.

［2］Elangovan S，Pathania R，Ramachandran S，et al.The niacin/butyrate receptor GPR109A suppresses mammary tumorigenesis by inhibiting cell survival［J］.Cancer Res，2014，74(4):1166.

［3］Yuan B Z，Miller M J，Keck C L，et al.Cloning，characterization，and chromosomal localization of a gene frequently deleted in human liver cancer(DLC-1)homologous to rat RhoGAP［J］.Cancer Res，1998，58(10):2196.

［4］Cao X，Voss C，Zhao B，et al.Differential regulation of the activity of deleted in liver cancer 1(DLC1)by tensins controls cell migration and transformation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(5):1455.

［5］Fan D M，Shi H R.Pilot study:alteration of deleted in liver cancer and phosphorylated focal adhesion kinase y397 cytoplasmic expression and the prognostic value in advanced epithelial ovarian carcinoma［J］.Int J Mol Sci，2011，12(12):8489.

［6］Chan F K，Chung S S，Ng IO，et al.The RhoA GTPase-Activating Protein DLC2 Modulates RhoA Activity and Hyperalgesia to Noxious Thermal and Inflammatory Stimuli［J］.Neurosignals，2011，28:32

［7］Yuan B Z，Jefferson A M，Baldwin K T，et al.DLC-1 operates as a tumor suppressor gene in human non-small cell lung carcinomas.［J］.Oncogene，2004，23(7):1405.

［8］Thomassen M1，Tan Q，Kruse TA.Gene expression meta-analysis identifies chromosomal regions and candidate genes involved in breast cancer metastasis［J］.Breast Cancer Res Treat，2009，113(2):239.

［9］Gurling HM，Critchley H，Datta SR，et al.Genetic association and brain morphology studies and the chromosome 8p22 pericentriolar material 1(PCM1)gene in susceptibility to schizophrenia.［J］.Arch Gen Psychiatry，2006，63(8):844.

［10］Guan M，Zhou X，Soulitzis N，et al.Aberrant methylation and deacetylation of deleted in liver cancer-1 gene in prostate cancer:potential clinical applications［J］.Clin Cancer Res，2006，12(5):1412.

［11］Adams J，Cuthbert-Heavens D，Bass S，et al.Infrequent mutation of TRAIL receptor 2(TRAIL-R2/DR5)in transitional cell carcinoma of the bladder with 8p21 loss of heterozygosity［J］.Cancer Lett，2005，220(2):137.

［12］Wilson PJ1，McGlinn E，Marsh A，et al.Sequence variants of DLC1 in colorectal and ovarian tumours［J］.Hum Mutat，2000，15(2):156.

［13］Wang Y，Lei R，Zhuang X，et al.DLC1-dependent parathyroid hormone-like hormone inhibition suppresses breast cancer bone metastasis［J］.J Clin Invest，2014，124(4):1646.

［14］Yin X L，Hui A B，Pang J C，et al.Genome-wide survey for chromosomal imbalances in ganglioglioma using comparative genomic hybridization［J］.Cancer Genet Cytogenet，2002，134(1):71.