齊 心，梅紀(jì)坤，張 燦

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東 青島266109)

隨著水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴(kuò)大,水貂經(jīng)過(guò)多年的人工馴化,長(zhǎng)期處于不良飼養(yǎng)環(huán)境下,導(dǎo)致其抗病能力出現(xiàn)大幅度降低,一旦發(fā)病就會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,這也是制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。綠膿桿菌又稱(chēng)為銅綠假單胞菌,廣泛存在于自然界中,能夠引起水貂出血性肺炎,嚴(yán)重危害水貂養(yǎng)殖業(yè)[1]。綠膿桿菌普遍存在較強(qiáng)耐藥性,據(jù)報(bào)道其對(duì)第三代頭孢菌素等的耐藥率高達(dá)60%,急需開(kāi)發(fā)新的抗生素替代品,用于綠膿桿菌病的防治[2]。

噬菌體是一種能夠特異性侵染細(xì)菌的病毒,在自然界中廣泛存在,影響著細(xì)菌的生態(tài)及進(jìn)化[3]。根據(jù)噬菌體侵入和裂解細(xì)菌的特點(diǎn),可將噬菌體分為溶源性噬菌體和烈性噬菌體[4]。烈性噬菌體通過(guò)識(shí)別宿主菌細(xì)胞表面受體吸附于細(xì)菌表面,進(jìn)而快速裂解細(xì)菌,具有種屬特異性強(qiáng)、不影響正常菌群、不受細(xì)菌耐藥性影響的優(yōu)點(diǎn),具有作為抗生素替代品的潛在開(kāi)發(fā)優(yōu)勢(shì)[5]。近年來(lái),烈性噬菌體廣泛應(yīng)用于食品消毒和細(xì)菌病的預(yù)防和治療[6-7]。

本試驗(yàn)用雙層平板法分離得到了1 株綠膿桿菌噬菌體,測(cè)定了該噬菌體的形態(tài)和生物學(xué)特性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)噬菌體制劑防治水貂綠膿桿菌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 27 株綠膿桿菌臨床分離株由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。水貂糞便樣本采集自青島市膠州水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離與純化 水貂糞樣加入500 mL LB 肉湯和27 株綠膿桿菌新鮮菌液各500 μL混勻,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),增殖噬菌體。樣品經(jīng)過(guò)濾、離心、抽濾后,各取100 μL 濾液分別加入等量27 株綠膿桿菌菌液,雙層平板法分離噬菌體[8]。用單斑法純化分離到的噬菌體[9]。

1.2.2 噬菌體的電鏡觀察 參照馬建偉等[9]報(bào)道的方法。取噬菌體增殖液滴于銅網(wǎng)上,2%磷鎢酸(PTA)染色,干燥后,透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.3 噬菌體裂解譜的測(cè)定 根據(jù)王杰等[10]報(bào)道的點(diǎn)樣法測(cè)定噬菌體的裂解譜。分別將27 株綠膿桿菌增殖液200 μL 均勻涂布于普通培養(yǎng)基平板,滴加噬菌體增殖液于平板,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)6 h。

1.2.4 噬菌體效價(jià)測(cè)定 將噬菌體增殖液10 倍比稀釋后,取100 μL 各稀釋度的增殖液分別與等量的菌液混勻,用雙層平板法進(jìn)行噬菌體效價(jià)的測(cè)定。

1.2.5 噬菌體對(duì)溫度、pH 值敏感性的測(cè)定 噬菌體增殖液分別加入不同pH 值(2 ～13)的LB 肉湯,37 ℃水浴分別作用1、2 h 和3 h,立即測(cè)定噬菌體效價(jià),繪制噬菌體phage30 的pH 值穩(wěn)定性曲線。100 μL 的噬菌體增殖液分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃水浴中作用20、40 min 和60 min,立即測(cè)定噬菌體效價(jià),繪制噬菌體phage30 的熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定 對(duì)噬菌體增殖液和對(duì)數(shù)期的宿主菌菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)。分別按照感染復(fù)數(shù)為0.001、0.01、0.1、1、10 和100 的比例混勻至LB 肉湯中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至搖清,雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。

1.2.7 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 參照Z(yǔ)hang C等[11]報(bào)道測(cè)定噬菌體一步生長(zhǎng)曲線,方法略有改動(dòng)。按最佳感染復(fù)數(shù)比例混勻噬菌體增殖液和宿主菌菌液,37 ℃孵育5 min,13 000 r/min 離心30 s,LB 肉湯重復(fù)洗滌兩次,棄上清。用LB 肉湯重懸沉淀,37 ℃震蕩培養(yǎng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)取200 μL 的增殖液,16 000 r/min 離心1 min,測(cè)噬菌體效價(jià)。繪制一步生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 綠膿桿菌噬菌體的分離與純化 通過(guò)雙層平板法分離得到一株噬菌體,命名為phage30。純化3代后,得到單一均勻圓形、清晰透明,邊緣光滑,直徑為1 ～2 mm 的噬菌斑(圖1)。測(cè)得其效價(jià)為4.3×1010PFU/mL。

圖1 噬菌體phage30 的噬菌斑形態(tài)

2.2 噬菌體的電鏡觀察 透射電鏡觀察phage30,由明顯的頭部和尾部構(gòu)成。頭部呈正二十面體,直徑約60 nm,尾部長(zhǎng)約180 nm,不可伸縮(圖2)。按照國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),屬于有尾噬菌體目,長(zhǎng)尾噬菌體科。

圖2 噬菌體phage30 的電鏡形態(tài)

2.3 噬菌體裂解譜的測(cè)定 點(diǎn)樣法測(cè)定噬菌體phage30 的裂解譜,結(jié)果表明,27 株綠膿桿菌中噬菌體phage30 能夠裂解8 株綠膿桿菌,裂解率為29.63%(8/27)。

2.4 噬菌體敏感性的測(cè)定

2.4.1 噬菌體phage30 的pH 值穩(wěn)定性測(cè)定 試驗(yàn)測(cè)定得到的phage30 的pH 值穩(wěn)定性曲線,見(jiàn)圖3。由圖3 可知,當(dāng)pH 值為5 ～11 時(shí),噬菌體phage30效價(jià)基本保持不變；當(dāng)pH 值＜5 或pH 值＞11 時(shí),噬菌體phage30 的裂解活性迅速下降。另外,噬菌體phage30 在同一pH 值條件下作用時(shí)間對(duì)噬菌體的裂解活性影響不大。因此當(dāng)pH 值為5 ～11 時(shí),噬菌體活性穩(wěn)定。

圖3 噬菌體phage30 的pH 值穩(wěn)定性

2.4.2 噬菌體phage30 熱穩(wěn)定性測(cè)定 試驗(yàn)測(cè)定得到的phage30 的熱穩(wěn)定性曲線,見(jiàn)圖4。噬菌體phage30 在40 ℃條件下,其效價(jià)基本保持不變,維持在1010以上；當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng),其效價(jià)明顯呈數(shù)量級(jí)下降,裂解活性迅速減弱甚至失活。因此,當(dāng)溫度在40 ℃以下的時(shí)候,噬菌體phage30 活性保持較好。

圖4 噬菌體phage30 的熱穩(wěn)定性

2.5 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定 噬菌體phage30最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知,當(dāng)MOI=0.01 時(shí),噬菌體phage30 的效價(jià)最高達(dá)到2.3×1010PFU/mL。根據(jù)結(jié)果計(jì)算噬菌體phage30的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。

2.6 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 測(cè)定得到噬菌體phage30 的一步生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖5。由圖5 可知,噬菌體phage30 的潛伏期約為60 min,爆發(fā)期約為120 min,裂解量約為156。

表1 噬菌體phage30 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

圖5 一步生長(zhǎng)曲線

3 討論

自然界中噬菌體的數(shù)量龐大可達(dá)1031,分布范圍廣[4]。由于細(xì)菌耐藥性的廣泛存在,噬菌體作為細(xì)菌的天敵,具有作為抗生素替代品的開(kāi)發(fā)潛力,近年來(lái)備受關(guān)注[5]。

本研究成功篩選到1 株綠膿桿菌噬菌體對(duì)其形態(tài)及生物學(xué)特征進(jìn)行了鑒定。電鏡形態(tài)觀察確定噬菌體phage30 由二十面體的頭部和不可伸縮的尾部組成,屬于有尾噬菌體目,長(zhǎng)尾噬菌體科。噬菌體phage30 的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01,表明噬菌體phage30 可以在較低濃度時(shí)有效裂解宿主菌,裂解性能高、殺菌效果好,這與徐彬等[12]報(bào)道的銅綠假單胞菌噬菌體D204 的最佳感染復(fù)數(shù)一致。不同的綠膿桿菌噬菌體其潛伏期、裂解量存在較大差異。郭棵棵等[13]分離到的綠膿桿菌噬菌體PaP6 的潛伏期為10 min,暴發(fā)期為50 min,裂解量為10；李亞輝等[14]分離的綠膿桿菌噬菌體PL39 的潛伏期為20 min,暴發(fā)期為5 min,裂解量為20。本試驗(yàn)分離到的綠膿桿菌噬菌體phage30 潛伏期為60 min,暴發(fā)期為120 min,裂解量為156。噬菌體的裂解量與其基因組特征密切相關(guān)。噬菌體基因組中tRNAs數(shù)量越多,越有利于噬菌體蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯,進(jìn)而提高噬菌體的增殖效率,縮短潛伏期的時(shí)間[15]。噬菌體phage30 潛伏期較長(zhǎng),暴發(fā)期長(zhǎng),裂解量高的原因尚需做進(jìn)一步基因組測(cè)序分析。

噬菌體對(duì)溫度和pH 值的耐受力是衡量噬菌體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。本研究測(cè)定了噬菌體phage30對(duì)溫度和pH 值的敏感性,發(fā)現(xiàn)其對(duì)溫度和pH 值的耐受力都較強(qiáng),這對(duì)環(huán)境中溫度和pH 值的不可掌控性來(lái)說(shuō)是很好的應(yīng)對(duì)機(jī)制。水貂的最適養(yǎng)殖溫度在20 ℃～35 ℃,使用酸性或堿性消毒劑凈化貂舍可導(dǎo)致環(huán)境pH 值發(fā)生變化。本次分離到的噬菌體phage30 在pH 值5 ～11、溫度40 ℃以下時(shí)其裂解活性基本保持不變,具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力。

噬菌體phage30 可專(zhuān)性裂解綠膿桿菌,具有宿主譜寬、裂解性能高、pH 值和熱穩(wěn)定性好的特征,有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值應(yīng)用于綠膿桿菌病的防治。