許可珍，黃軼群，黃秀旺，馬旭東

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院1．藥學(xué)部、2．血液內(nèi)科，福建漳州 363000；3．福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350004）

下調(diào)組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1的表達(dá)引起人白血病Molt-4細(xì)胞的凋亡

許可珍1，黃軼群2，黃秀旺3，馬旭東2

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院1．藥學(xué)部、2．血液內(nèi)科，福建漳州 363000；3．福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350004）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R341．27；R341．7；R329．25；R733．7；R977．4；R977．6

摘要：目的 觀察LSD1基因?qū)θ祟惣毙訲淋巴母細(xì)胞性白血病Molt-4細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 設(shè)計(jì)并篩選出針對(duì)LSD1基因的最佳siRNA片段，將其轉(zhuǎn)染入Molt-4細(xì)胞后，MTS法觀察LSD1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡；Western blot檢測(cè)LSD1 siRNA作用后組蛋白H3K4、H3K9甲基化及組蛋白H3乙?；癄顟B(tài)，以及p15、DNA甲基化酶1（DNMT1）和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、pro-caspase-3的表達(dá)變化。結(jié)果 沉默LSD1基因可抑制細(xì)胞增殖，LSD1 siRNA濃度為0、30、60、120 nmol·L－1作用48 h后，Molt-4細(xì)胞的增殖率分別為（99.65±1.21）%、（83.02± 1.69）%、（65.72±2.16）%、（41.15±2.23）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LSD1 siRNA以60 nmol·L－1的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞0、24、48、72 h，增殖率分別為（99.86± 1.35）%、（65.72±2.16）%、（48.26±1.92）%、（37.86± 1.66）%，P＜0.05，提示LSD1 siRNA可以抑制Molt-4細(xì)胞的增殖。LSD1 siRNA 0、30、60、120 nmol·L－1作用48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（3.35±1.26）%、（12.16±1.74）%、（32.74±2.47）%、（54.64±2.58）%，P＜0.05，凋亡率隨著LSD1 siRNA濃度的增加逐漸上升；同時(shí)出現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、procaspase-3的表達(dá)下降；LSD1 siRNA抑制LSD1蛋白及LSD1 mRNA，上調(diào)組蛋白H3K4一甲基化、二甲基化及組蛋白H3的乙?；?，H3K4三甲基化、H3K9甲基化水平無明顯變化；LSD1 siRNA下調(diào)DNA去甲基化酶DNMT1的表達(dá)，上調(diào)p15的表達(dá)。結(jié)論 LSD1 siRNA能抑制Molt-4細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與表觀遺傳學(xué)調(diào)控有關(guān)，有望成為白血病治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：急性白血病；LSD1；組蛋白；甲基化；乙?；?；表觀遺傳學(xué)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．048．html

賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine spe-cific demethylase 1，LSD1）是2004年被人們發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)組蛋白賴氨酸去甲基化酶。LSD1定位于細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制，在腫瘤發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用。它是一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinulcleotide，F(xiàn)AD）依賴性胺氧化酶，能夠特異性地脫去組蛋白H3第4位賴氨酸（H3K4）和H3K9位點(diǎn)上的單甲基化和二甲基化甲基基團(tuán)［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，LSD1可通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生，例如LSD1可能廣

泛地調(diào)控基因表達(dá)并且參與前列腺癌的進(jìn)展及惡化［2］，與乳腺癌、卵巢癌、肝癌的發(fā)展也密切相關(guān)［3－5］。

目前H3K4去基化酶LSD1的研究不多，特別是用對(duì)RNAi沉默技術(shù)研究LSD1后腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡以及對(duì)組蛋白調(diào)控及DNA甲基化影響的報(bào)告少見。本研究通過RNAi沉默LSD1基因，探討LSD1基因?qū)毙訲淋巴母細(xì)胞性白血病Molt-4細(xì)胞增殖、凋亡及組蛋白甲基化、乙酰化及DNA甲基化的影響，探討LSD1基因在白血病靶向治療中的可能性。

1　材料與方法

1．1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），siRNA及PCR引物委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Li-pofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM RT-PCR試劑盒、DNA Marker試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，細(xì)胞增殖檢測(cè)（MTS）試劑盒（Promega公司），Annex-in V-FITC／PI雙染試劑盒（BD公司），一抗：p15、Bcl-2、procaspase-3（美國(guó)Santa Cruz公司），Anti-ac-etyl-Histone H3、Anti-acetyl-Histone H4、Anti-trimeth-yl-Histone H3（Lys9）、Anti-acetyl-Histone H3 （Lys9）、Anti-acetyl-Histone H3（Lys14）、Anti-acetyl-Histone H3（Lys27）購(gòu)自美國(guó)Upsate公司。羊抗兔、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）。

1．2Molt-4細(xì)胞培養(yǎng) Molt-4細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Molt-4細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（含青霉素105U· L－1＋鏈霉素100 mg·L－1）并在37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。將Molt-4細(xì)胞復(fù)蘇后，2～3 d規(guī)律傳代。轉(zhuǎn)染前選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心收集并接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)／孔。

1．3靶序列的選擇 siRNA的有關(guān)序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，為了避免只選擇一個(gè)序列可能出現(xiàn)無效或低效的情況，我們根據(jù)確定序列的原則選擇4條靶序列，并用RT-PCR法篩選最佳LSD1基因的siRNA片段為：上游5′-CCAC-GAGUCAAACCUUUAUTT-3′；下游5′-AUAAAGGU UUGACUCGUGGTT-3′。

1．4RT-PCR法觀察LSD1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞LSD1 mRNA表達(dá)的影響 設(shè)定陰性對(duì)照組、0、30、60、120 nmol·L－1LSD1 siRNA處理組。每孔總體積為2 mL。37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度法鑒定、定量，A260／A280比值均為1.8～2.0，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反應(yīng)所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將β-actin（上游引物：5′-GAGACCTTCA AGAC-CCCAGCC-3′，下游引物：5′-TCGGGGCATCGGAAC-CGCTCA-3′）與LSD1引物按1∶2的比例混合。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min（預(yù)變性），95℃45 s（變性），61℃45 s（退火），72℃45 s（延伸），40個(gè)循環(huán)，最終延伸72℃10 min。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液以5∶1混合后，16 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠圖像分析儀上自動(dòng)分析成像，觀察效果最佳LSD1 siRNA片段對(duì)Molt-4細(xì)胞LSD1 mRNA表達(dá)的影響。

1．5MTS法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 取3個(gè)96孔板，每個(gè)96孔板中接種Molt-4細(xì)胞2×104個(gè)／孔，分別加入適量的LSD1 siRNA使終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1，終體積為100 μL。每組設(shè)6個(gè)平行孔，轉(zhuǎn)染后置于5%CO2飽和濕度、37℃的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于24、48、72 h分別收獲一個(gè)板內(nèi)的4組細(xì)胞。將MTS和PMS按20∶1的體積比混合成混合液，每孔加20 μL的上述混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度即OD值（單波長(zhǎng)492 nm），記錄試驗(yàn)結(jié)果，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率／%＝（OD實(shí)驗(yàn)－OD空白）／（OD對(duì)照－OD空白）×100%。以細(xì)胞增殖率為縱軸、時(shí)間為橫軸繪制細(xì)胞增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡 LSD1 siRNA使終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1，分別培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，方法及步驟參照BD公司試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．7Western blot檢測(cè)干擾后LSD1蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、p15蛋白、組蛋白H3K4一、二甲基化、H3K9甲基化、H3乙酰化狀態(tài)及DNA甲基化酶DNMT1的表達(dá) 用不同濃度的LSD1 siRNA處理Molt-4細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106的濃度，加入裂解液與酶抑制劑（100∶1）100 μL充分裂解細(xì)胞；低溫（4℃）12 000 r ·min－1離心15 min，吸取中間清亮層，收集蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，－20℃保存?zhèn)溆?。取備用蛋白，?2%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1 h；加入用TBS稀釋的一抗4℃過夜，TBS洗滌液洗膜后分別加入二抗，室溫下孵育1 h，TBS洗膜后加入化學(xué)發(fā)光工作液，在X射線膠片（KODAK）上曝光，以β-actin為內(nèi)參，用AlphaDigi-Doc圖像分析軟件進(jìn)行分析比較。

1．8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)

行結(jié)果處理，常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、正態(tài)性檢驗(yàn)。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，并進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2．1LSD1 siRNA下調(diào)LSD1 mRNA及其蛋白的表達(dá) 分別將濃度為0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1-2045 RNAi片段轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞的mRNA進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。如Fig 1A所示，LSD1 siRNA轉(zhuǎn)染后LSD1 mRNA受到抑制，且與濃度相關(guān)。各組LSD1 mRNA條帶灰度值與β-actin比值分別為：0.967±0.124、0.302±0.083、0.153± 0.082、0.091±0.024，各組與β-actin比值統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05（Fig 1A）。與對(duì)照組相比，經(jīng)LSD1 RNA干擾后，LSD1蛋白的表達(dá)量隨著siRNA作用濃度的增加而逐漸減少，其中120 nmol·L－1組減少最明顯，下降了67.67%（Fig 1B）。

Fig 1 Transfection of LSD1 siRNA in Molt-4 cells

2．2LSD1 siRNA抑制Molt-4細(xì)胞增殖 經(jīng)終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1 siRNA作用24、48、72 h后，Molt-4細(xì)胞的增殖率變化見Fig 2，隨LSD1 siRNA濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖率逐漸下降，呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。

2．3LSD1 siRNA誘導(dǎo)Molt-4細(xì)胞凋亡 經(jīng)30、60、120 nmol·L－1的LSD1 siRNA處理48 h后，Molt-4細(xì)胞的凋亡率分別為（12.16±1.74）%、（32.74±2.47）%、（54.64±2.58）%，而對(duì)照組為（3.35±1.26）%，細(xì)胞的凋亡率隨著LSD1 siRNA濃度的增加逐漸上升（P＜0.05）。LSD1 siRNA濃度與凋亡率有明顯的量效關(guān)系（Fig 3）。

2．4LSD1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白、DNMT1及p15的影響 經(jīng)終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1的siRNA轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞48 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)隨著LSD1 siRNA終濃度的增加而逐漸減少，分別比對(duì)照組減少33.70%、55.62%、79.78%；procaspase-3隨著siRNA處理濃度的增加表達(dá)量也逐漸下降，分別比對(duì)照組減少33.69%、54.35%、77.17%；同時(shí)，隨著siRNA處理濃度的增加，抑癌基因p15的表達(dá)量逐漸增加，分別比對(duì)照組增加1.21倍、2.71倍、4.58倍；而DNMT1蛋白的表達(dá)則逐漸減弱，分別比對(duì)照組減少22.47%、71.35%、88.76%（P＜0.05）（Fig 4）。

Fig 2 Deceased cell proliferation of Molt-4 cells after transfected with LSD1 siRNA in different concentrations and in different time

Fig 3 Induction of cells apoptosis after transfected with LSD1 siRNA Molt-4 cells for 48 hours

2．5LSD1 RNAi對(duì)Molt-4細(xì)胞組蛋白甲基化和乙?；挠绊?LSD1 siRNA終濃度為30、60、120 nmol·L－1處理Molt-4細(xì)胞48 h后，組蛋白H3K4

一甲基化和二甲基化表達(dá)隨siRNA濃度增加而增強(qiáng)；組蛋白H3K4三甲基化水平不變；組蛋白H3K9一甲基化和二甲基化水平也幾乎不變；組蛋白H3乙?；诫SsiRNA濃度增加而表達(dá)增強(qiáng)（Fig 5）。

Fig 4 Alteration of apoptosis-related protein and DNMT1，p15 protein in Molt-4 cells after transfected with indicated concentrations of LSD1 siRNA for 24 h

3　討論

一般認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與癌基因的異常激活或過度表達(dá)有關(guān)，而抑癌基因的失活也可能使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。表觀遺傳學(xué)的改變對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起了重要的作用。組蛋白H3K4去基化酶LSD1在表觀遺傳學(xué)中發(fā)揮了重要作用，其在多種腫瘤表達(dá)異常，說明它對(duì)腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究以RNA干擾技術(shù)削減急性淋巴細(xì)胞白血病Molt-4細(xì)胞的LSD1表達(dá)，觀察白血病細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)的變化及增殖、凋亡的影響，探討LSD1作為抗腫瘤靶點(diǎn)的可能性。

特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的主要策略之一。2010年Kontaki等［6］首先報(bào)告當(dāng)DNA損傷時(shí)，set和LSD1分別對(duì)E2F1-K185me進(jìn)行去甲基化修飾，使其更遠(yuǎn)的乙?；土姿峄饕饔糜诩?xì)胞周期的G1期到S期的過渡，并通過激活p53、p73等輔助因子，即p53依賴和非p53依賴細(xì)胞凋亡通路，激活大量凋亡前基因。本研究結(jié)果顯示，LSD1 siRNA干擾LSD1基因后可促進(jìn)Molt-4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、procaspase-3裂解，觸發(fā)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率隨著LSD1 siRNA濃度的增加逐漸上升（P＜0.05）；Wang等［7］鑒定出DN-MT1是LSD1的新底物。DNMT1可被LSD1去甲基化，引起DNA甲基化的失衡。p15（Ink4b）基因?qū)儆谝职┗蛑兄芷诘鞍滓蕾囆约っ敢种埔蜃樱–K-Is）第二大家族，通過抑制CDK4／6，從而抑制Rb蛋白磷酸化，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而減少細(xì)胞的異常生長(zhǎng)及變異，阻止腫瘤發(fā)生和發(fā)展。沉默LSD1基因可下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1），使抑癌基因p15去甲基化而表達(dá)上調(diào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

Fig 5 Alteration of histone methylation and acetylation modification of Molt-4 cells after transfection with indicated concentrations of LSD1 siRNA for 24 h

本研究還發(fā)現(xiàn)沉默LSD1后，H3K4的一甲基化和二甲基化水平逐漸增強(qiáng)，組蛋白H3乙?；缴险{(diào)，而H3K4的三甲基化及H3K9的一甲基化和二甲基化未發(fā)生改變。Shi等［1］和Nicholson等［8］的實(shí)驗(yàn)顯示在FAD的參與下，LSD1在體外可以特異去除組蛋白H3第4位賴氨酸（H3K4）的二甲基和一甲基修飾。而三甲基則需要亞胺陽離子中間體才能介導(dǎo)對(duì)H3K4三甲基的去甲基化反應(yīng)。LSD1不

是H3K9去甲基化酶，但有文獻(xiàn)報(bào)告LSD1可在體內(nèi)才能去除H3K9的二甲基和一甲基修飾［9］。Miao等［10］研究發(fā)現(xiàn)：組蛋白H3-K4Me2、H3-K4Me3、H3-K36Me2和H3-K79Me2與高度乙酰化和基因激活都有關(guān)系。因此，可以推導(dǎo)出：當(dāng)組蛋白H3-K4Me2表達(dá)增加時(shí)，可引起組蛋白高度乙酰化，從而使組蛋白H3乙?；黾印?/p>

本研究提示干擾LSD1基因后腫瘤細(xì)胞發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變，進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞受到抑制，有望成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)在閩南師范大學(xué)生物科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室的老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持。）

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Effects of silencing LSD1 gene on Molt-4 cells apoptosis

XU Ke-zhen1，HUANG Yi-qun2，HUANG Xiu-wang3，MA Xu-dong2
（1．Dept of Pharmacy，2．Dept of Hematology，Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Zhangzhou Fujian 363000，China；3．School of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，China）

Abstract：Aim To observe the effect of the LSD1 gene on the proliferation and apoptosis of Molt-4 cells，a kind of human acute T-lymphoblastic leukemia cells．Methods siRNA fragment based on LSD1 gene was designed，filtered out and then transfected into Molt-4 cells．The effects of LSD 1 siRNA on Molt-4 cell prolif-eration were observed by the method of MTS．The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry．The states of histone H3K4，H3K9 methylation，histone H3 acetyla-tion，p15，DNA methyltransferase 1（DNMT1），and apoptosis-related proteins like Bcl-2，procaspase-3 were evaluated by Western blot．Results Silencing LSD1 gene inhibited cell proliferation．Molt-4 cell pro-liferation rate was（99.65±1.21）%，（83.02± 1.69）%，（65.72±2.16）%，and（41.15±2.23）% respectively after the treatment of Molt-4 cells with 0，30，60，120 nmol·L－1of LSD1 siRNA after 48 hours （P＜0.05）．Cell proliferation rate was（99.86± 1.35）%，（65.72±2.16）%，（48.26±1.92）%，and （37.86±1.66）%respectively after the transfection of Molt-4 cells with 60 nmol·L－1of LSD1 siRNA after 0，24，48，72 hours（P＜0.05）．Cell apoptosis rate was（3.35±1.26）%，（12.16±1.74）%，（32.74 ±2.47）%，（54.64±2.58）%respectively after transfection of LSD1 siRNA in indicated concentrations for 48 hours（P＜0.05）．At the same time，the ex-pression levels of apoptosis-related proteins like Bcl-2，procaspase-3 decreased．LSD1 siRNA inhibited LSD1 and LSD1 mRNA，and accumulated histone mono-，and di-methylation H3K4 and histone H3 acetylation．However，alteration of H3K4 trimethylation，H3K9 methylation was not detected．LSD1 siRNA downregu-lated DNA demethylase DNMT1 and upregulated p15．Conclusions LSD1 siRNA can inhibit Molt-4 cell proliferation and induce apoptosis．Its mechanism may be associated with epigenetic regulation．In addition，it is expected to become a new target for leukemia treat-ment．

Key words：acute leukemia；LSD1；histone；methyla-tion；acetylation；epigenetics

作者簡(jiǎn)介：許可珍（1979－），女，碩士，主管藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，Tel：0596-2082381，E-mail：xkz868＠163．com；馬旭東（1957－），女，碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：血液腫瘤學(xué)，通訊作者，Tel：0596-2082021，F(xiàn)ax：0596-2593904，E-mail：maxudong005＠hotmail．com

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2012J01420）；漳州市科學(xué)研究發(fā)展計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（No 20100080）；福建省引進(jìn)重大項(xiàng)目計(jì)劃基金（No 2012I2004）；福建醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)科研項(xiàng)目（No FZS13004Z）；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（No 2012-CX-32）

收稿日期：2015－06－13，修回日期：2015－07－15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1603－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．024