呂躍瑋,劉 潔,史淑寧,郭建友,劉 勇,石晉麗
(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.中國(guó)科學(xué)院心理研究所心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101)
復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)急性應(yīng)激大鼠的抗焦慮作用及對(duì)大鼠腦內(nèi)ERK/CREB信號(hào)通路和BDNF表達(dá)的影響
呂躍瑋1,劉 潔1,史淑寧1,郭建友2,劉 勇1,石晉麗1
(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.中國(guó)科學(xué)院心理研究所心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101)
中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào):R-332;R282.71;R322.81;R749.72;R977.6
摘要:目的 研究復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)急性應(yīng)激大鼠的藥效及其對(duì)大鼠腦皮層及海馬ERK/CREB信號(hào)通路、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的影響。方法 采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn),觀察了復(fù)方抗焦慮膠囊低、中、高劑量(0.75、1.5、3 g· kg-1)給藥7 d對(duì)急性應(yīng)激大鼠行為的影響,采用Western blot免疫印跡法研究復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)ERK/CREB信號(hào)通路的影響,對(duì)急性應(yīng)激大鼠腦皮層及海馬BDNF表達(dá)的影響。結(jié)果 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)顯示,復(fù)方抗焦慮膠囊高劑量組可明顯增加大鼠進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間的百分?jǐn)?shù)(OT%)(P<0.05)和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)的百分?jǐn)?shù)(OE%)(P<0.05)。West-ern blot實(shí)驗(yàn)顯示,復(fù)方抗焦慮膠囊中劑量組明顯減少了海馬中p-ERK1/2的表達(dá)(P<0.05);高劑量組明顯減少了大鼠皮層和海馬中p-ERK1/2和p-CREB的表達(dá)(P<0.05)。高劑量組明顯增加了大鼠皮層及海馬中BDNF的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論 復(fù)方抗焦慮膠囊在高架十字迷宮模型中具有抗焦慮作用,且其抗焦慮機(jī)制可能與影響ERK/CREB信號(hào)通路,增加BDNF表達(dá)有關(guān)系。
關(guān)鍵詞:復(fù)方抗焦慮膠囊;急性應(yīng)激;高架十字迷宮;ERK/CREB信號(hào)通路;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF);Western blot免疫印跡法
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-10-16 9:52 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20151016.0952.052.html
焦慮癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的精神疾病,成為日益增長(zhǎng)的全球健康問(wèn)題。焦慮癥以急性焦慮反復(fù)發(fā)作為特征,臨床表現(xiàn)為廣泛性焦慮和發(fā)作性驚恐狀態(tài)2種形式。臨床上以恐懼、緊張不安等精神障礙為主要表現(xiàn),并伴有心悸、多汗、胸悶、呼吸窘迫以及睡眠障礙等[1]。在精神障礙中,焦慮癥的終生患病率最高,影響到30%人口的壽命[2-3]。在我國(guó),焦慮癥已成為現(xiàn)代常見(jiàn)病和多發(fā)病,嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。因此,焦慮癥的有效治療成為亟待解決的問(wèn)題。
苯二氮卓類(lèi)藥物已被證明是有效的抗焦慮藥,如地西泮[4]等,但這些化合物存在明顯的副作用,如鎮(zhèn)靜、肌肉松弛、遺忘和依賴(lài)性[5-7]。并且抗焦慮藥物的服藥時(shí)程長(zhǎng),易導(dǎo)致戒斷反應(yīng)、反跳和依賴(lài)。臨床證實(shí),中藥治療焦慮癥不僅安全有效、副作用小,還具有改善其它相關(guān)癥狀的作用[8]。因此,研究開(kāi)發(fā)療效好、副作用小的中藥抗焦慮新藥成為近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)。
復(fù)方抗焦慮膠囊(antianxietic compound pre-scription capsule,ACPC)來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方,由蜘蛛香、合歡皮、炒酸棗仁、燈心草組成,功能理氣解郁、養(yǎng)血安神,主要治療肝郁氣滯、心神不寧型焦慮癥。前期研究表明,該復(fù)方具有穩(wěn)定的抗焦慮作用,且不影響動(dòng)物的自主行為活動(dòng),其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)
GABAA受體[9-10]、Cdk5/p35通路的表達(dá),抑制腦中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及調(diào)節(jié)免疫功能紊亂相關(guān)[11]。為了更加深入地對(duì)復(fù)方抗焦慮膠囊的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià),明確其作用特點(diǎn),為其安全有效的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù),本實(shí)驗(yàn)探討了復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)急性應(yīng)激大鼠的作用及其機(jī)制。
1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD♂大鼠,體質(zhì)量150~170 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)(2012-0001)。
1.2藥品與試劑 ①蜘蛛香藥材購(gòu)自云南省師宗縣,炒酸棗仁、合歡皮和燈心草購(gòu)于河北省安國(guó)市藺氏有限責(zé)任公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定,蜘蛛香為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖及根;酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa (Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥種子;合歡皮為豆科植物合歡Albizzia julibrissin Durazz.的樹(shù)皮;燈心草為燈心草科植物燈心草Juncus effuses L.的干燥莖髓。蜘蛛香、炒酸棗仁、合歡皮、燈心草(均為干浸膏)按照12∶9∶9∶1的質(zhì)量比混合,再加入0.5倍干膏量的糊精混勻,制成顆粒,干燥,分裝,即得復(fù)方抗焦慮膠囊(含橙皮苷1.05 mg·g-1、酸棗仁皂苷A 7.50 mg·g-1),實(shí)驗(yàn)前用氯化鈉注射液將其制成溶液備用。②地西泮(diazepam,DZP),2.5 mg ×20片,國(guó)藥準(zhǔn)字H11020898,北京益民藥業(yè)有限公司,批號(hào)20120305。③氯化鈉注射液,國(guó)藥準(zhǔn)字H37020764,山東齊都藥業(yè)有限公司,批號(hào)1012081004。④RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺、膜再生液、封閉用脫脂奶粉均購(gòu)自北京普利萊生物科技有限公司;過(guò)硫酸銨(ammonium persulphate,AP)為美國(guó)Amersco公司產(chǎn)品;甲叉雙丙稀酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;三氨基甲烷(Tris)、甘氨酸購(gòu)自美國(guó)Novon公司;p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB抗體為Cell Signaling公司產(chǎn)品;β-actin單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記山羊抗兔及兔抗山羊二抗均為中杉金橋公司產(chǎn)品;ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒及光譜彩虹預(yù)染蛋白Marker均為康為公司產(chǎn)品;PVDF膜為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品;其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.3儀器
1.3.1高架十字迷宮 大鼠高架十字迷宮(ANIL-AB)包括兩個(gè)閉臂(50.9 cm,寬10.4 cm,高40.9 cm)與兩個(gè)開(kāi)臂(50.9 cm,寬10.4 cm),距地面74.3 cm。
1.3.2束縛管 聚乙烯材料束縛管自制(規(guī)格:長(zhǎng)22.6 cm,直徑7.9 cm)。
1.3.3Western blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)儀器 超聲勻漿機(jī)(USA Sonic公司)、高速冷凍離心機(jī)(Beckman Al-legra 64R)、移液器(1 000、200、100、20 μL)(德國(guó)Eppendorf公司)、UNIC7200型分光光度儀(上海UNIC公司)、-80℃低溫冰箱(Forma,美國(guó))、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)、恒溫水浴搖床(上海比朗儀器有限公司)、多用脫色搖床、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Multiskan EX PRIMA-RY EIA V.2.3)。
2.1造模與分組 大鼠單籠飼養(yǎng),將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、膠囊低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性藥物組,共6組,每組8只。其中低、中、高劑量組分別按0.75、1.5、3 g·kg-1·d-1給予灌胃,DZP組給予1.0 mg·kg-1·d-1灌胃,空白組和模型組灌服等容積的生理鹽水,連續(xù)7 d灌胃給藥,d 5、6、7除空白組外,其他各組在給予藥物后進(jìn)行急性應(yīng)激造模。于d 5各組灌胃后,參照文獻(xiàn)[12]造模方法并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn),除空白對(duì)照組外的其余各組動(dòng)物放進(jìn)束縛裝置,束縛管只限制大鼠的活動(dòng)范圍,對(duì)其呼吸并無(wú)抑制。束縛期間禁食禁水,束縛結(jié)束后恢復(fù)自由。每次刺激30 min,每日1次,連續(xù)3 d。d 7給藥束縛后,進(jìn)行高架十字迷宮測(cè)試。
2.2對(duì)急性應(yīng)激大鼠高架十字迷宮行為的影響迷宮測(cè)試前,將每只大鼠放入一個(gè)45 cm×30 cm× 15 cm塑料盒中,任其自由探究5 min后迅速置于EPM的中央平臺(tái)處,使其頭部正對(duì)其中一個(gè)開(kāi)放臂,采用紅外線(xiàn)技術(shù)記錄5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。每次測(cè)試完成后,用紙巾清除糞便,隨后濕布蘸取酒精擦拭迷宮,繼而用干布擦凈后再進(jìn)行下一只大鼠的測(cè)試。記錄5 min內(nèi)動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)(open arm entry,OE)、閉臂次數(shù)(close arm entry,CE)及迷宮中央?yún)^(qū)內(nèi)的次數(shù)及在開(kāi)臂與閉臂內(nèi)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。以進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)與總?cè)氡鄞螖?shù)的百分比(the percentage of entries to the open arms,OE%)及在開(kāi)臂內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)間與開(kāi)臂閉臂內(nèi)的總時(shí)間的百分比(the percentage of time spent in the open arms,OT%)代表抗焦慮作用指標(biāo)。
2.3Western blot檢測(cè)急性應(yīng)激大鼠腦皮層及海馬ERK/CREB信號(hào)通路和BDNF的表達(dá)
2.3.1取材 大鼠急性應(yīng)激EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,立即斷頭處死,迅速取出大腦,于冰盤(pán)上快速分離出海
馬及皮層,隨后于-80℃低溫冰箱中凍存待用。
2.3.2組織裂解 取約200 mg海馬或皮層組織,加入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液冰浴超聲3×4 s,4℃下12 000 r·min-1離心10 min后吸取上清,采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度后分裝,立即95℃煮10 min使蛋白變性,防止蛋白降解,煮后的蛋白可-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.3.3Western blot測(cè)定 按Western blot方法測(cè)定p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá),目的蛋白表達(dá)量與內(nèi)參蛋白表達(dá)量的比值作為組織內(nèi)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
Western blot具體操作步驟如下:灌膠與上樣:配制12%分離膠,加水封膠。分離膠凝固后將水盡量倒干凈,用濾紙吸干分離膠殘留的水,配制5%的濃縮膠,灌入制膠板,插入樣品梳。待到濃縮膠凝固后,取出樣品梳。加入50 μg蛋白的上樣樣品至1.5 mL離心管中,加入5×loading buffer上樣緩沖液至終濃度為1×,加足量的running buffer后上樣。
電泳:110 V電壓恒壓電泳2 h,電泳至溴酚蘭即將跑出,即可終止電泳,停止電泳,拆開(kāi)膠板,棄去濃縮膠,取出分離膠。
轉(zhuǎn)膜操作:將PVDF膜在無(wú)水甲醇中浸泡至膜變成灰色透明,馬上取出,放入去離子水中浸泡2 min,隨即放入預(yù)冷的1×轉(zhuǎn)膜Buffer中浸泡,浸泡凝膠30 min,濾紙、海綿20 min,以1×轉(zhuǎn)膜Buffer注滿(mǎn)電轉(zhuǎn)膜槽,接通電泳儀,以0.23 mA電流恒流轉(zhuǎn)膜1 h。
免疫反應(yīng):將膜用TBST從下向上浸濕后,移至含有封閉液的保鮮盒中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h后,4℃冰箱封閉過(guò)夜。將p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB、CREB與β-actin蛋白抗體以1×TBST稀釋?zhuān)?∶1 000),將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,4℃冰箱中孵育過(guò)夜。然后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10 min。同上方法二抗結(jié)合(1 ∶8 000),室溫下孵育1 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10 min,隨后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
化學(xué)發(fā)光、顯影、定影:取ECL發(fā)光工作液A和B兩種試劑各500 μL混合后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸1 min,將膜用保鮮膜包好后移至X光壓片夾后,進(jìn)入暗室曝光X片。曝光結(jié)束后,放入顯影液中顯影并定影,自來(lái)水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干。
凝膠圖像分析:將膠片進(jìn)行掃描拍照,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。
2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量數(shù)據(jù)使用±s表示。多組間比較采用(One-way ANOVA)單因素方差分析,兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)法,方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3進(jìn)行兩兩比較。
3.1復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)急性應(yīng)激大鼠高架十字迷宮行為的影響 與空白組相比,模型組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間的百分?jǐn)?shù)(OT%)和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)的百分?jǐn)?shù)(OE%)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,DZP組、復(fù)方抗焦慮膠囊高劑量組均可明顯增加大鼠進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間的百分?jǐn)?shù)(P<0.05)和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)的百分?jǐn)?shù)(P<0.01,P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)Tab 1。
Tab 1 Effect of ACPC on EPM behavior of acute stress in rats(±s,n=8)
Tab 1 Effect of ACPC on EPM behavior of acute stress in rats(±s,n=8)
#P<0.05 vs control;*P<0.05,**P<0.01 vs model.
Group Dosage/g·kg-1OT% OE% Control?。?3.39±4.51 38.42±5.63 Model?。?5.74±3.53# 18.98±3.54#Diazepam 0.001 32.58±4.99 36.24±3.10**ACPC Low dose 0.75 17.76±3.92 23.25±4.92 Middle dose 1.5 21.62±5.98 26.61±5.62 High dose 3 26.68±2.41 29.26±2.31*F -2.143 1.738 P -0.081 0.149
3.2復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)ERK/CREB通路的影響與空白組相比,各組大鼠皮層與海馬的總ERK表達(dá)水平差異無(wú)顯著性,模型組大鼠的p-ERK1/2的表達(dá)量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,地西泮組明顯減少p-ERK1/2在海馬和皮層中的表達(dá)量(P <0.05);復(fù)方抗焦慮膠囊中劑量組明顯減少海馬中p-ERK1/2的表達(dá)(P<0.05);復(fù)方抗焦慮膠囊高劑量組明顯減少了大鼠皮層和海馬中p-ERK1/2的表達(dá)(P<0.05)。與空白組相比,模型組大鼠的p-CREB的表達(dá)量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,地西泮組明顯減少p-CREB在海馬和皮層中的表達(dá)量(P<0.05);復(fù)方抗焦慮膠囊高劑量組明顯減少大鼠皮層和海馬中p-CREB的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)Tab 2~5及Fig 1。
3.3復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)急性應(yīng)激大鼠腦皮層及海馬BDNF表達(dá)的影響 與空白組相比,模型大鼠的海馬和皮層中BDNF的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01);與模型組相比,地西泮組明顯增加了大鼠皮層與海馬中BDNF的表達(dá)水平(P<0.01,P<0.05);復(fù)方抗焦慮膠囊高劑量組明顯增加了大鼠
皮層及海馬中BDNF的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)Tab 6和Fig 2。
束縛應(yīng)激是一種有效的焦慮應(yīng)激模型,通過(guò)數(shù)次強(qiáng)度、時(shí)間一致的束縛之后,可誘發(fā)動(dòng)物出現(xiàn)排尿排便增多、修飾行為明顯增多等行為指標(biāo),同時(shí),還會(huì)影響體內(nèi)激素及內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化,這些生理反應(yīng)正是焦慮患者體內(nèi)的生理變化。
Tab 2 The p-ERK1/2,ERK1/2 protein levels in cerebral cortex of rats(±s,n=8)
Tab 2 The p-ERK1/2,ERK1/2 protein levels in cerebral cortex of rats(±s,n=8)
##P<0.01 vs control;*P<0.05 vs model.
Group Dosage/g·kg-1 p-ERK1/2/β-actin ERK1/2/β-actin Control?。?.247±0.020 1.352±0.036 Model - 0.448±0.026#?!?.441±0.050 Diazepam 0.001 0.324±0.040 1.306±0.040 ACPC Low dose 0.75 0.423±0.036 1.275±0.030 Middle dose 1.5 0.369±0.028 1.378±0.034 High dose 3 0.326±0.020 1.297±0.045 F- 9.003 2.805 P - 0.000 0.028
Tab 3 The p-ERK1/2,ERK1/2 protein levels in hippocampus of rats(±s,n=8)
Tab 3 The p-ERK1/2,ERK1/2 protein levels in hippocampus of rats(±s,n=8)
##P<0.01 vs control;*P<0.05 vs model.
Group Dosage/g·kg-1 p-ERK1/2/β-actin ERK1/2/β-actin Control?。?.289±0.035 1.231±0.044 Model?。?.408±0.029#?!?.268±0.029 Diazepam 0.001 0.334±0.026 1.193±0.056 ACPC Low dose 0.75 0.391±0.020 1.124±0.041 Middle dose 1.5 0.353±0.022 1.302±0.032 High dose 3 0.358±0.017 1.201±0.037 F- 4.418 2.704 P - 0.003 0.033
Tab 4 The p-CREB,CREB protein levels in cerebral cortex of rats(±s,n=8)
Tab 4 The p-CREB,CREB protein levels in cerebral cortex of rats(±s,n=8)
##P<0.01 vs control;*P<0.05 vs model.
Group Dosage/g·kg-1 p-CREB/β-actin CREB/β-actin Control - 0.384±0.030 0.889±0.019 Model?。?.543±0.034#?!?.912±0.017 Diazepam 0.001 0.417±0.027 0.944±0.021 ACPC Low dose 0.75 0.500±0.036 0.862±0.024 Middle dose 1.5 0.469±0.028 0.933±0.018 High dose 3 0.448±0.029 0.819±0.022 F- 9.861 16.026 P - 0.000 0.000
Tab 5 The p-CREB,CREB protein levels in hippocampus of rats(±s,n=8)
Tab 5 The p-CREB,CREB protein levels in hippocampus of rats(±s,n=8)
##P<0.01 vs control;*P<0.05 vs model.
Group Dosage/g·kg-1 p-CREB/β-actin CREB/β-actin Control?。?.452±0.038 0.783±0.024 Model - 0.606±0.023#?!?.817±0.029 Diazepam 0.001 0.511±0.025 0.788±0.016 ACPC Low dose 0.75 0.579±0.031 0.832±0.020 Middle dose 1.5 0.523±0.029 0.761±0.022 High dose 3 0.478±0.037 0.796±0.019 F- 43.561 6.699 P - 0.000 0.000
Fig 1 Protein expression by Western blot in all groups
Tab 6 The BDNF protein level in cerebral cortex and hippocampus of rats(±s,n=8)
Tab 6 The BDNF protein level in cerebral cortex and hippocampus of rats(±s,n=8)
##P<0.01 vs control;*P<0.05,**P<0.01 vs model.
Group Dosage/g·kg-1BDNF/β-actin (cerebral cortex)BDNF/β-actin (hippocampus)Control?。?.63±0.07 0.58±0.05 Model?。?.37±0.03#?!?.34±0.04##Diazepam 0.001 0.57±0.05 0.53±0.06*ACPC Low dose 0.75 0.40±0.05 0.38±0.05 Middle dose 1.5 0.42±0.04 0.38±0.04 High dose 3 0.54±0.06 0.55±0.05**F- 18.315 55.110 P - 0.000 0.000
生物學(xué)研究認(rèn)為,調(diào)節(jié)正常和病理性焦慮狀態(tài)的神經(jīng)生物學(xué)通路異常是導(dǎo)致焦慮障礙的原因。而海馬和皮層中ERK-CERB信號(hào)通路被認(rèn)為可能與焦慮有關(guān)[13]。研究表明,焦慮大鼠腦內(nèi)p-ERK1/2含量明顯增加,且PD98059阻斷其磷酸化后,可產(chǎn)
生明顯抗焦慮的作用[14]。Meller等[15]發(fā)現(xiàn),急慢性束縛應(yīng)激可引起大鼠海馬中p-ERK1/2的不同變化,大鼠急性束縛30 min后,海馬中p-ERK1/2含量明顯增加,慢性束縛應(yīng)激11 d后,海馬中p-ERK1/2含量明顯減少。CREB轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)和對(duì)緊張、焦慮的潛在作用也被廣泛研究,Lu等[16]研究表明,28 d慢性應(yīng)激大鼠海馬中p-ERK1/2與p-CREB的含量均明顯減少。然而,也有研究表明14 d壓力誘導(dǎo)大鼠海馬中的p-ERK1/2與p-CREB的含量均升高[17]。通過(guò)以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),不同時(shí)間應(yīng)激對(duì)p-ERK1/2與p-CREB的含量調(diào)控是雙向的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠采用3 d急性束縛應(yīng)激,束縛大鼠表現(xiàn)為易受驚嚇、易激惹、被毛豎立;束縛組大鼠在高架十字迷宮模型中表現(xiàn)為排尿、排便次數(shù)增多,呈現(xiàn)焦慮狀,且與空白組相比,開(kāi)臂時(shí)間與次數(shù)百分比明顯減少,提示3 d造??墒勾笫螽a(chǎn)生焦慮。
Fig 2 BDNF expression by Western blot in all groups
因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠海馬和皮層中p-ERK1/2 與p-CREB的含量進(jìn)行測(cè)定,以明確復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)3 d急性束縛應(yīng)激模型大鼠ERK-CERB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)方式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,束縛應(yīng)激會(huì)增強(qiáng)ERK-CREB通路的活化,導(dǎo)致磷酸化ERK和磷酸化CREB含量的增加,而地西泮和復(fù)方抗焦慮膠囊會(huì)抑制ERK-CREB過(guò)度的磷酸化,提示復(fù)方抗焦慮膠囊可能通過(guò)影響ERK-CREB信號(hào)通路產(chǎn)生抗焦慮作用。
BDNF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,自1989年其cDNA結(jié)構(gòu)被闡明以來(lái),對(duì)BDNF的分布及功能有了廣泛的深入研究。研究發(fā)現(xiàn),BDNF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元和突觸的可塑性,對(duì)中樞神經(jīng)元的增殖和修護(hù)有巨大的意義,而焦慮癥的治療也與神經(jīng)元和突觸的形成有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)激模型導(dǎo)致大鼠皮層及海馬中BDNF明顯減少,而復(fù)方抗焦慮膠囊可以明顯抵消這種減少,從而對(duì)皮層和海馬產(chǎn)生保護(hù)作用。
ERK-CREB通路與BDNF蛋白的表達(dá)關(guān)系密切,ERK-CREB通路的變化可以影響B(tài)DNF蛋白的表達(dá)。BDNF蛋白參與急性焦慮信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)ERK-CREB通路和BDNF蛋白的表達(dá)都有明顯的影響,表現(xiàn)為抑制ERK-CREB通路的磷酸化與增加BDNF的表達(dá),因此提示膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)它們的相互反應(yīng)而發(fā)揮其抗焦慮作用。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方抗焦慮膠囊對(duì)急性應(yīng)激模型大鼠具有一定的抗焦慮作用,并且其作用機(jī)制可能與影響ERK-CREB信號(hào)通路及BDNF的表達(dá)有關(guān)系,但它們之間深層次的相互影響有待于進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn):
[1] 周吉銀,周世文,湯建林.中藥復(fù)方制劑抗焦慮作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2010,21(11):1044-7.
[1] Zhou J Y,Zhou S W,Tang J L.Research progress on the anti-anxiety effect of traditional Chinese medicinal herbs prescriptions [J].China Pharm,2010,21(11):1044-7.
[2] Demyttenaere K,Bruffaerts R,Posada-Villa J,et al.Prevalence,severity,and unmet need for treatment of mental disorders in the World Health Organization World Mental Health Surveys[J].JA-MA,2004,291(21):2581-90.
[3] Kessler R C,Berglund P,Demler O,et al.Lifetime prevalence and age-of-onset distributions of DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication[J].Arch Gen Psychiatry,2005,62(6):593-602.
[4] 謝 云,唐月月,魏晶晶,等.地西泮對(duì)焦慮、抑郁小鼠體重、痛閾和自主活動(dòng)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26 (11):1529-30.
[4] Xie Y,Tang Y Y,Wei J J,et al.The effect of diazepam on the weight,pain threshold and independent activity of anxious mice and depressive mice[J].Chin Pharmacol Bull,2010,26(11):1529-30.
[5] Gardner C R,Tully W R,Hedgecock C J.The rapidly expanding range of neuronal benzodiazepine receptor ligands[J].Prog Neu-robiol,1993,40(1):1-61.
[6] Rickels K,Garcia-Espana F,Mandos L A,et al.Physician with-drawal checklist(PWC-20)[J].J Clin Psychopharmacol,2008,28(4):447-51.
[7] Youssef N A,Rich C L.Does acute treatment with sedatives/hyp-notics for anxiety in depressed patients affect suicide risk?A litera-ture review[J].Ann Clin Psychiatry,2008,20(3):157-69.
[8] 楊 陽(yáng).中藥治療焦慮障礙顯優(yōu)勢(shì)[N].健康報(bào),2013-1-8 (007).
[8] Yang Y.Traditional Chinese medicine treatment of anxiety disor-der[N].Health Report,2013-1-8(007).
[9] Wang Y L,Shi J L,Liu Y,et al.Anxiolytic-like effects of com-pound zhi zhu xiang in rat[J].Evid Based Complement Alternat Med,2012,2012:701289.
[10]彭 敏,石晉麗,鄭虎占,等.蜘蛛香抗焦慮復(fù)方的抗焦慮作用及其機(jī)制[J].中草藥,2011,42(11):2283-6.
[10]Peng M,Shi J L,Zheng H Z,et al.Anxiolytic-like effects of anti-anxietic compound prescription with valerianae jatamansi rhizoma et radix[J].Chin Tradit Herb Drugs,2011,42(11):2283-6.
[11]王延麗.復(fù)方馬蹄香抗焦慮膠囊藥效學(xué)研究及機(jī)制探討[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2011.
[11]Wang Y L.Pharmacodynamic study of the anxiolytic effect on Compound Ma Ti Xiang Capsule[D].Beijing:Beijing University of Chinese Medicine,2011.
[12]Ortiz J,F(xiàn)itzgerald L W,Lane S,et al.Biochemical adaptations in the mesolimbic dopamine system in response to repeated stress [J].Neuropsychopharmacology,1996,14(6):443-52
[13]Paul S,Olausson P,Venkitaramani D V,et al.The striatal-en-riched protein tyrosine phosphatase gates longterm potentiation and fear memory in the lateral amygdala[J].Biol Psychiatry,2007,61(9):1049-61.
[14]Fu A L,Liu F,Sui L,et al.Role of extracellular signal-regulated kinase signal transduction pathway in anxiety[J].J Psychiatr Res,2008,43(1):55-63.
◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇
[15]Meller E,Shen C,Nikolao T A,et al.Region-specific effects of acute and repeated restraint stress on the phosphorylation of mito-gen-activated protein kinases[J].Brain Res,2003,979(1-2):57-64.
[16]Lu J,Liang J,Wang J R,et al.Acupuncture activates ERK-CREB pathway in rats exposed to chronic unpredictable mild stress[J].Evid Based Complement Alterna Med,2013,2013:469765.
[17]Bravo J A,Diaz-Veliz G,Mora S,et al.Desipramine prevents stress-induced changes in depressive-like behavior and hippocam-pal markers of neuroprotection[J].Behav Pharmacol,2009,20 (3):273-85.
Anxiolytic effect of antianxietic compound prescription capsule on acute stress in rats and influence upon expression of ERK/CREB signaling pathway and BDNF in the brain of rats
LYU Yue-wei1,LIU Jie1,SHI Shu-ning1,GUO Jian-you2,LIU Yong1,SHI Jin-li1
(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China;2.Key Laboratory of Mental Health,Institute of Psychology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)
Abstract:Aim To study the pharmacodynamics of antianxietic compound prescription capsule(ACPC)on acute stress in rats and the influence upon the ex-pression of ERK/CREB signal pathway and brain-de-rived neurotrophic factor(BDNF)in the cerebral cor-tex and hippocampus of rats.Methods The elevated plus maze(EPM)test was applied to observe the effects of ACPC on acute stress rats administered 7 d low-,medium-and high-dose(0.75,1.5,3 g· kg-1).The expression of ERK/CREB signal pathway and BDNF in the cerebral cortex and hippocampus of rats were studied by using Western blot method.Re-sults In EPM,high-dose of ACPC increased signifi-cantly the rat open arm time(OT%)(P<0.05)and the percentage of open arm entries(OE%)(P< 0.05).In Western blot,the medium-dose of ACPC reduced significantly p-ERK1/2 expression in hippo-campus(P<0.05),and high-dose group decreased significantly the expression of p-ERK1/2 and p-CREB in the cortex and hippocampus of rats(P<0.05).High-dose group increased significantly the expression of BDNF in the cortex and hippocampus of rats(P<0.05,P<0.01).Conclusion ACPC has anti-anxie-ty effect in the model of EPM,and its mechanism may be related to the ERK/CREB signal pathway and in-creased BDNF expression.
Key words:antianxietic compound prescription cap-sule(ACPC);acute stress;elevated plus maze (EPM)test;ERK/CREB signal pathway;brain de-rived neurotrophic factor(BDNF);Western blot
作者簡(jiǎn)介:呂躍瑋(1990-),男,碩士生,研究方向:中藥創(chuàng)新藥物,E-mail:lvyuewei100@126.com;石晉麗(1967-),女,博士,教授,研究方向:中藥創(chuàng)新藥物,通訊作者,Tel:010-84738623,E-mail:shijl@vip.sina.com
基金項(xiàng)目:國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(No 2012ZX09102-201-018)
收稿日期:2015-07-28,修回日期:2015-09-01
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1001-1978(2015)11-1614-06
doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.11.026
中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)2015年11期