易 嵐，李林蔚，譚 暉，何 潔，胡勁松，謝紅艷，蘇 琦

（南華大學(xué)1.藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院、2．腫瘤研究所，湖南衡陽 421001）

DADS對人白血病細胞和淋巴瘤細胞誘導(dǎo)凋亡作用比較研究

易 嵐1，2，李林蔚1，譚 暉2，何 潔2，胡勁松1，謝紅艷1，蘇 琦2

（南華大學(xué)1.藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院、2．腫瘤研究所，湖南衡陽 421001）

A comparative study of apoptosis in diallyl disul-fide-induced human leukemia cells and lymphoma cells

YI Lan1，2，LI Lin-wei1，TAN Hui2，HE Jie2，HU Jing-song1，XIE Hong-yan1，SU Qi2
（1．College of Pharmacy and Biological Sciences，2．Cancer Re-search Institute，University of South China，Hengyang，Hunan，421001，China）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．060．html

大蒜及其烯丙基硫化物的抗腫瘤作用正日益受到關(guān)注［1－2］。我們的前期研究顯示，DADS對人白血病HL-60細胞具有雙效作用，小劑量DADS（＜1.25 mg·L－1）誘導(dǎo)人白血病細胞分化，而中等劑量DADS（＞1．25 mg·L－1）可誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡［3－4］。我們的前期研究表明，Rac2與DADS誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡相關(guān)［5］，且DADS通過活性氧介導(dǎo)的JNK信號通路誘導(dǎo)HL-60細胞的凋亡，且NADPH氧化酶的活化是DADS誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡過程ROS的主要來源［6－7］。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，比較DADS對人早幼粒白血病系HL-60細胞、人慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞、人何杰金式淋巴瘤細胞系Raji細胞的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用，同時也比較了DADS對這3種細胞活性氧產(chǎn)生以及Rac2的表達的影響。為進一步闡明DADS誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制，為腫瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡治療提供新思路。

1　材料與方法

1．1藥品與試劑 DADS為Fluka公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品；2′，7′-二氯氫化熒光素二脂（DCFH-DA），Rac2等一抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品（sc-96）。二抗（sc-2774）為Abcam Biotechnology公司產(chǎn)品。

1．2方法

1．2．1細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，飽和濕度，5%CO2，每3－4天換液傳代。

1．2．2MTT檢測 細胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)72 h。于結(jié)束前4 h除對照組外，每孔加MTT溶液孵育4 h，終止培養(yǎng)。離心棄上清。酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔吸光度，檢測波長570 nm，按下列公式計算抑制率（IR%）。IR%＝（1－實驗組OD570／對照組OD570）×100%。

1．2．3RT-PCR檢測 利用Primer Premier 5．0軟件進行引物設(shè)計。β-actin正義引物序列為5′-CCTGTACGCCAACA-CAGTGC-3′，反義引物序列為：5′-ATACTCCTGCTTGCT-GATCC-3′，產(chǎn)物長度為211 bp；RAC2正義引物序列為：5′-TCATCTGCTTCTCCCTCGT-3′，反義引物序列為：5′-GATG-GTGTCCTTGTCGTCC-3′，產(chǎn)物長度為143 bp。提取細胞總RNA；cDNA合成；PCR反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．2．4細胞內(nèi)活性氧檢測 收集細胞，加入DCFH-DA充分混勻，常溫避光反應(yīng)50 min，洗滌細胞3次，重懸細胞，37℃條件下水浴10 min，流式細胞儀分析熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

1．2．5Western blot檢測 細胞裂解：分別收集各組細胞，加入裂解液，冰上裂解，獲細胞總蛋白。蛋白變性，電泳，轉(zhuǎn)膜；封閉，孵一抗，洗膜，孵二抗，洗膜后，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1．2．6凋亡細胞百分率檢測 收集細胞，預(yù)冷PBS重懸，離心。用75%乙醇固定細胞，加碘化丙啶（PI），避光振蕩混勻，DNA含量低于2n的細胞百分數(shù)為凋亡細胞百分率。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，Student′t-test法進行差異顯著性分析，數(shù)值用±s表示。

2　結(jié)果

2．1DADS對HL-60細胞、K562細胞、Raji細胞增殖抑制作用 MTT實驗結(jié)果顯示，DADS以劑量依賴方式抑制這3種細胞的生長活性，DADS作用HL-60、K562、Raji細胞的IC50值結(jié)果也表明，相同濃度的DADS對K562細胞、HL-60細胞的生長抑制作用明顯強于對Raji細胞的生長抑制作用（P＜0.05）。

Tab 1 OD570value of different concentration DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 48 h

2．2DADS對HL-60細胞、K562細胞、Raji細胞誘導(dǎo)凋亡作用 流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞百分率結(jié)果顯示，DADS能誘導(dǎo)人白血病HL-60細胞、K562細胞以及Raji細胞凋亡。相同濃度DADS作用上述3種細胞，Raji凋亡細胞百分率明顯低于HL-60細胞和K562細胞（P＜0.05）。

Tab 2 Percentage of apoptosis cells of different concentrations of DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 24 h．

2．3DADS對HL-60細胞、K562細胞、Raji細胞活性氧產(chǎn)生的影響 DCFH-DA染色后，流式細胞術(shù)檢測細胞熒光強度結(jié)果顯示，3.0、6.0、12.0 mg·L－1DADS作用上述3種細胞8 h后，HL-60細胞、K562細胞的熒光強度呈濃度依賴性增加，但在24．0 mg·L－1DADS作用下，熒光強度稍有下降。相同濃度DADS作用Raji細胞，細胞內(nèi)熒光強度明顯低于HL-60細胞和K562細胞（P＜0.05）。

Tab 3 Fluorescence intensity of different concentrations of DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 8 h

2．4DADS對HL-60細胞、K562細胞、Raji細胞Rac2表達的影響 RT-PCR、Western blot分析結(jié)果顯示：6．0 mg·L－1DADS作用HL-60細胞和K562細胞24 h后，較未處理組相比，Rac2的表達均明顯上調(diào)（P＜0.05）；而12．0 mg·L－1DADS作用Raji細胞24 h后，較未處理組相比，Rac2的表達卻明顯下調(diào)（P＜0.05）。

3　討論

本研究表明，首先，DADS作為一種有潛力的抗腫瘤藥物，不僅能抑制HL-60細胞、K562細胞以及Raji細胞的活性和增殖，同時能誘導(dǎo)這3種細胞凋亡，且DADS對HL-60細胞、K562細胞的抑制增殖能力和誘導(dǎo)凋亡能力明顯強于Raji細胞人白血病HL-60細胞凋亡。其次，在DADS誘導(dǎo)3種細胞凋亡的過程中均有ROS的增加，NADPH氧化酶的活化是DADS誘導(dǎo)HL-60細胞、K562細胞凋亡過程ROS的主要來源，而不是DADS誘導(dǎo)Raji細胞凋亡過程中ROS的主要來源。當(dāng)然，DADS誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用效果以及具體機制還有待于進一步研究。

參考文獻：

［1］ Yi L，Su Q．Molecular mechanisms for the anti-cancer effects of diallyl disulfide［J］．Food and Chem Toxicol，2013，57：362－70．

［2］ Huang YS，Xie N，Su Q，et al．Diallyl disulfide inhibits the prolif-eration of HT-29 human colon cancer cells by inducing differential-ly expressed genes［J］．Mol Med Report，2011，4（3）：553－9．

［3］ Zhao J，Huang W G，He J，et al．Diallyl disulfide suppresses growth of HL-60 cell through increasing histone acetylation and p21WAF1 expression in vivo and in vitro［J］．Acta Pharmacol Sin，2006，27（11）：1459－66．

［4］ 黃衛(wèi)國，譚 暉，易 嵐，等．二烯丙基二硫上調(diào)p21、STAT1 和CAMTA1誘導(dǎo)人白血病K562細胞分化［J］．中國藥理學(xué)通報，2010，26（4）：513－6．

［4］ Huang W G，Tan H，Yi L，et al．Diallyl disulfide up-regulate p21、STAT1 and CAMTA1 induce differentiation of human leuke-mia K562 cells［J］．Chin Pharmacol Bull，2010，26（4）：513－6．

［5］ Yi L，Zeng X，Tang H，et al．Proteomics analysis of apoptosis ini-tiation induced by diallyl disulfide in human leukemia HL-60 cells ［J］．Chin J Cancer，2009，28（1）：43－8．

［6］ 易 嵐，譚 暉，吉曉霞，等．DADS通過活性氧介導(dǎo)的JNK信號通路誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡［J］．中國藥理學(xué)通報，2013，29（4）：473－7．

［6］ Yi L，Tan H，Ji X X，et al．Diallyl disulfide induces apoptosis in human leukemia K562 cells through activation of JNK mediated by reactive oxygen［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29（4）：473－7．

［7］ 易 嵐，伍尤華，譚 暉，等．二烯丙基二硫活化NADPH氧化酶誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡［J］．中國藥理學(xué)通報，2014，30（8）：1107－12．

［7］ Yi L，Wu Y H，Tan H，et al．Diallyl disulfide induces apoptosis in human leukemia K562 cells through activation of NADPH oxidase ［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30（8）：1107－12．

中國圖書分類號：R329．25；R733．7；R733．41；R916．4

關(guān)鍵詞：DADS；HL-60細胞；K562細胞；Raji細胞；Rac2；活性氧；凋亡

Key words：DADS；HL-60 cells；K562 cells；Raji cells；Rac2；ROS；apoptosis

作者簡介：易 嵐（1976－），女，博士，副教授，研究方向：白血病發(fā)病及防治分子機制，Tel：0734-8281659，E-mail：yilanoky＠126．com；蘇 琦（1945－），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤發(fā)病及防治分子機制，通訊作者，Tel／Fax：0734-8281547，E-mail：suqi1＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81400117）；中國博士后基金（No 2014M562115）；湖南省自然科學(xué)基金資助項目（No 2015JJ4042）；南華大學(xué)歸國人員科研啟動資金項目（No 2014XQD46）

收稿日期：2015－07－13，修回日期：2015－08－23

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1627－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．030