孫 杰，孫文佳，陳北冬，趙艷陽，鮑 利，吳 偉，齊若梅

（北京醫(yī)院／北京老年醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)計(jì)委老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

白藜蘆醇降低ox-LDL誘導(dǎo)血小板ROS產(chǎn)生和PECAM-1表達(dá)的分子機(jī)制研究

孫 杰，孫文佳，陳北冬，趙艷陽，鮑 利，吳 偉，齊若梅

（北京醫(yī)院／北京老年醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)計(jì)委老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

中國圖書分類號：R284．1；R331．124；R392．11；R345.57；R543.5

摘要：目的 探討白藜蘆醇對ox-LDL刺激血小板的ROS產(chǎn)生和PECAM-1表達(dá)的影響以及相關(guān)的分子機(jī)制。方法 用ox-LDL刺激血小板，應(yīng)用Western blot檢測PECAM-1、Sirt1的表達(dá)以及p38MAPK的磷酸化。用熒光試劑盒檢測ROS水平。結(jié)果 ①ox-LDL刺激血小板時(shí)聚集率為14%，100 μmol·L－1白藜蘆醇抑制了血小板聚集，抑制率為50%。②白藜蘆醇減少了ox-LDL誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生約3．2倍，并抑制了PECAM-1表達(dá)。③ox-LDL刺激血小板時(shí)Sirt1表達(dá)降低，白藜蘆醇（100 μmol·L－1）逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。Sirt1抑制劑EX527增加了血小板ROS水平和PECAM-1表達(dá)。④白藜蘆醇抑制了ox-LDL刺激的p38MAPK磷酸化。結(jié)論 白藜蘆醇能夠降低ox-LDL誘導(dǎo)的血小板聚集、抑制ROS產(chǎn)生，以及降低PECAM-1的表達(dá)，其分子機(jī)制與增加Sirt1的表達(dá)相關(guān)。此外，白藜蘆醇抑制PECAM-1表達(dá)與抑制p38MAPK磷酸化相關(guān)。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；ox-LDL；血小板；ROS；PECAM-1；Sirt1；p38MAPK

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．050．html

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病變是一種復(fù)雜的慢性血管炎癥性疾病，血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和血小板功能均有改變［1］。機(jī)體的增齡變化、有害代謝產(chǎn)物的堆積以及氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加，均是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。大量研究顯示ox-LDL能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［2－3］。ox-LDL能夠刺激血小板活化，促進(jìn)血栓形成。活化的血小板通過釋放細(xì)胞因子等炎癥蛋白，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的血管炎癥反應(yīng)。

白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是多酚類物質(zhì)，在葡萄籽和紅酒中有較高的含量。研究發(fā)現(xiàn)［4－5］，RSV是天然的抗氧化劑，具有增加細(xì)胞內(nèi)保護(hù)分子Sirt1表達(dá)，抗炎和抑制血栓形成的作用。Sirt1是近年來醫(yī)學(xué)研究十分關(guān)注的細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)性分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝與長壽中起十分重要的作用［6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，限制小鼠熱量攝取，能夠降低小鼠的能量代謝水平，增加Sirt1的表達(dá)，延長小鼠壽命［7］。很多研究已經(jīng)確認(rèn)Sirt1與機(jī)體長壽相關(guān)，是一個(gè)長壽基因［8－9］。研究也證實(shí)RSV是Sirt1的激動(dòng)劑，RSV能夠增加細(xì)胞內(nèi)Sirt1表達(dá)，減輕有害刺激對細(xì)胞的損傷，具有多種生物學(xué)保護(hù)作用。然而，RSV是否能夠抑制ox-LDL刺激的血小板活化尚不清楚。本研究重點(diǎn)觀察了RSV對ox-LDL誘導(dǎo)的血小板聚集、ROS產(chǎn)生、以及PECAM-1表達(dá)的影響，并對相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。

1　材料與方法

1．1藥品與試劑 白藜蘆醇購自Sigma公司，純度為99%（貨號：R5010）?？筆ECAM-1、抗β-actin抗體購自Santa Cruz公司；抗Sirt1抗體購自Millipore公司；抗p38MAPK和抗phospho-p38MAPK抗體購自Cell Signaling公司。辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、兔抗山羊二抗購自北京中杉金橋公司?；钚匝鯔z測試劑盒（S0033）購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1．2ox-LDL的制備 收集新鮮人血清，用梯度超速離心法分離低密度脂蛋白。使用5 μmol·L－1硫酸銅氧化低密度脂蛋白，37℃，10 h，加入1 mmol· L－1EDTA終止氧化反應(yīng)。然后用PBS（pH 7.3）4℃透析24 h。用0.22 μm的Millex濾器過濾，用BCA法測定LDL蛋白濃度，4℃儲存。

1．3制備洗滌血小板 取健康正常人血液，1 200 r ·min－1離心10 min，分離上清，得到富血小板血漿。加入TYRODE Buffer（138 mmol·L－1NaCl，3.3 mmol·L－1NaH2PO4，2.9 mmol·L－1KCl，1 mmol ·L－1MgCl2，5.5 mmol·L－1glucose，20 mmol· L－1HEPES，pH 7.2）和9∶1的ACD（2.5%trisodi-um citrate，2.0%glucose，1.5%citric acid），2 mmol

·L－1EDTA，混勻，1 400 r·min－1離心10 min。棄上清，懸浮細(xì)胞。再次離心，獲得洗滌血小板。將血小板懸浮液室溫靜置30 min后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．4血小板聚集測定 使用Chrono-Log血小板聚集分析儀測定血小板聚集，血小板聚集率由血小板聚集分析儀的軟件計(jì)算。取血小板懸浮液300 μL置于測定通道內(nèi)，攪拌1 min，加入ox-LDL（0.1 g· L－1）刺激血小板10 min；藥物干預(yù)組將100 μmol ·L－1RSV孵育血小板10 min，放入測定通道。攪拌1 min，再加入ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激血小板10 min，終止反應(yīng)，獲得血小板聚集曲線。

1．5活性氧（ROS）測定 使用活性氧檢測試劑盒，將熒光探針DCFH-DA（1∶1 000）孵育血小板，37℃，30min，洗滌血小板3次。血小板細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度用CARY Eclipse熒光分光光度計(jì)測定，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。陽性對照組用ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激細(xì)胞10 min，藥物處理組用100 μmol·L－1RSV孵育血小板10 min，再加入ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激細(xì)胞10 min，開始測定熒光強(qiáng)度。

1．6Western blot方法檢測蛋白表達(dá) 分別用各種濃度的RSV（1、10、100 μmol·L－1）、p38MAPK抑制劑SB203580（0．1、0．3、1 μmol·L－1）以及Sirt1抑制劑EX527（10、30、100 nmol·L－1）預(yù)孵育血小板10 min，加入ox-LDL（0．1 g·L－1）刺激血小板10 min，終止反應(yīng)。采用BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫下封閉PVDF膜2 h，洗膜3次。分別加入特異性抗體（PECAM-1、Sirt1、p38MAPK、phospho-p38MAPK、β-actin），4℃，過夜。用TBS-T（100 mmol·L－1Tris，150 mmol·L－1NaCl，0．1%Tween，pH 7.2）洗膜3次，每次5 min。加入相應(yīng)二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h。用TBS-T洗膜4次，每次5 min。最后，加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀成像。

1．7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)來源于至少4次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示，采用雙尾單因素方差分析以及Student t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1白藜蘆醇對血小板聚集的影響 血小板聚集分析顯示，ox-LDL（0．1 g·L－1）刺激血小板誘導(dǎo)了輕度的血小板聚集，聚集率為14%（Fig 1A），而使用100 μmol·L－1白藜蘆醇孵育10 min血小板后，血小板聚集受到抑制，聚集率為7%（Fig 1B）。白藜蘆醇的血小板聚集抑制率為50%，兩組之間存在明顯差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（Fig 1C）。

2．2白藜蘆醇對ox-LDL誘導(dǎo)的血小板ROS產(chǎn)生的影響 ox-LDL為氧化型脂質(zhì)產(chǎn)物，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示，ox-LDL（0.1 g ·L－1）刺激血小板ROS產(chǎn)生增加了11.5倍，與正常對照組比較，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。白藜蘆醇處理的血小板與ox-LDL組比較，ROS產(chǎn)生減少了3.2倍，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（Fig 2）。

2．3白藜蘆醇對ox-LDL誘導(dǎo)的血小板PECAM-1表達(dá)的影響 Platelet endothelial cell adhesion mole-cule-1（PECAM-1）是血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)促進(jìn)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附反應(yīng)。結(jié)果顯示，ox-LDL刺激血小板后PECAM-1表達(dá)增加，而白藜蘆醇以劑量依賴的方式抑制了PECAM-1表達(dá)，與ox-LDL組比較，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 3）。

Fig 1 Effect of RSV on platelet aggregation induced by ox-LDL

Fig 2 Effects of RSV on ROS production in ox-LDL-stimulated platelets

Fig 3 Effects of RSV on PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

Fig 4 Effects of RSV on Sirt1 expression in platelets

2．4白藜蘆醇對ox-LDL誘導(dǎo)的血小板Sirt1表達(dá)的影響 研究已經(jīng)提示白藜蘆醇是Sirt1的激活劑，本研究觀察了白藜蘆醇對ox-LDL刺激血小板活化時(shí)Sirt1的變化。當(dāng)ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激血小板時(shí)Sirt1的表達(dá)下降了18%，與對照組比較，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。與ox-LDL組比較，白藜蘆醇（1、10、100 μmol·L－1）以濃度依賴的方式恢復(fù)了Sirt1的表達(dá)（Fig 4A）。此外，我們觀察白藜蘆醇單獨(dú)處理對血小板Sirt1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，各種濃度的白藜蘆醇（1、10、100 μmol· L－1）孵育血小板10 mim，各組細(xì)胞Sirt1的表達(dá)沒有明顯變化（Fig 4B）。這一結(jié)果提示，ox-LDL刺激

血小板時(shí)保護(hù)性分子Sirt1受到損傷，出現(xiàn)了表達(dá)降低的變化，而白藜蘆醇能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。

2．5EX527對ox-LDL誘導(dǎo)的血小板ROS水平及PECAM-1表達(dá)的影響 EX527是Sirt1特異性抑制劑，為了分析白藜蘆醇抑制ox-LDL刺激血小板ROS產(chǎn)生及PECAM-1表達(dá)是否與Sirt1相關(guān)，以及Sirt1是否調(diào)控ROS產(chǎn)生及PECAM-1表達(dá)。我們使用了不同濃度的EX527（10、30、100 nmol·L－1）處理血小板。結(jié)果顯示，在一個(gè)高濃度100 nmol·L－1EX527處理的血小板ROS產(chǎn)生明顯增加，與ox-LDL刺激組比較，二組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（Fig 5A）。同樣EX527處理的血小板PE-CAM-1表達(dá)也明顯增加（P＜0.05）（Fig 5B，C）。這一結(jié)果提示，病理?xiàng)l件下增加的ROS產(chǎn)生以及PE-CAM-1表達(dá)可能與Sirt1表達(dá)／活性降低相關(guān)聯(lián)。

2．6白藜蘆醇對ox-LDL刺激血小板p38MAPK磷酸化的影響 先前的研究表明，p38MAPK參與多種血小板誘導(dǎo)劑刺激的血小板活化，如膠原（colla-gen）、凝血酶（thrombin）和ADP［10］。本研究我們觀察了ox-LDL刺激血小板后p38MAPK的影響。結(jié)果顯示，ox-LDL刺激血小板后p38MAPK磷酸化水平增加了2．4倍，與對照組比較有明顯差異（P＜0.01）。白藜蘆醇（100 μmol·L－1）明顯抑制了p38MAPK的磷酸化（P＜0.05）（Fig 6）。

2．7SB203580對ox-LDL誘導(dǎo)的血小板ROS產(chǎn)生及PECAM-1表達(dá)的影響 為了確認(rèn)白藜蘆醇降低ROS產(chǎn)生以及PECAM-1表達(dá)的藥理作用是否與抑制p38MAPK相關(guān)，我們使用p38MAPK的抑制劑SB203580，分析其對ox-LDL刺激血小板ROS產(chǎn)生和PECAM-1表達(dá)的影響。我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)1 μmol·L－1SB203580能夠完全抑制p38MAPK磷酸化。結(jié)果顯示，1 μmol·L－1SB203580不能抑制ox-LDL刺激的血小板ROS產(chǎn)生（Fig 7A）。進(jìn)一步，我們觀察了SB203580對PECAM-1的影響。結(jié)果顯示，與ox-LDL組比較，SB203580（0.1、0.3、1 μmol· L－1）明顯抑制了ox-LDL刺激血小板PECAM-1的表達(dá)，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（Fig 7B，C）。這一結(jié)果提示，p38MAPK參與調(diào)控PE-CAM-1表達(dá)，但對ROS產(chǎn)生無明顯影響。白藜蘆醇抑制ox-LDL誘導(dǎo)血小板過表達(dá)PECAM-1可能與抑制p38MAPK磷酸化相聯(lián)系。

3　討論

Fig 5 Effects of EX527 on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

血小板活化在動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中是一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，然而，近年大量研究顯示，血小板在動(dòng)脈粥樣硬化的早期炎癥過程中通過釋放炎癥介質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的血管炎癥。機(jī)體脂質(zhì)代謝失調(diào)導(dǎo)致血脂成分增加，循環(huán)中的ox-LDL增加，不僅損傷內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)也能影響血小板功能。最近，我們以及其他的研究均證實(shí)，ox-LDL能夠使內(nèi)皮細(xì)胞炎癥蛋白表達(dá)增高，也能促進(jìn)血小板的聚集。因此，抑制ox-LDL損傷內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化，對于防治動(dòng)脈粥樣硬化血管炎癥和血栓形成具有重要意義。血小板是由骨髓巨核細(xì)胞脫落而成的無核細(xì)胞，近年研究發(fā)現(xiàn)，血小板有豐富的mRNA存在，具有合成蛋白的能力。最近，Denis等［11］報(bào)告，血小板含有剪

接體和小核RNA以及mRNA前體，在血小板活化時(shí)能夠轉(zhuǎn)化為成熟mRNA，促進(jìn)血小板炎癥蛋白表達(dá)。我們的結(jié)果也證實(shí)血小板活化時(shí)炎癥蛋白表達(dá)增加。

Fig 6 Effects of RSV on p38MAPK phosphorylation in ox-LDL-stimulated platelets

白藜蘆醇又稱為芪三酚，主要來源于葡萄、虎杖、桑椹等植物，具有抗氧化及抗炎的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示［12］，白藜蘆醇能夠改善高熱量高膽固醇飲食引起的內(nèi)皮損傷。白藜蘆醇的抗氧化作用可能與增加細(xì)胞內(nèi)Sirt1表達(dá)相關(guān)［13－14］。在體實(shí)驗(yàn)研究表明，通過熱量限制和運(yùn)動(dòng)等方式可以促進(jìn)Sirt1表達(dá)［15］。然而，Sirt1對血小板功能的調(diào)控尚不清楚。我們的結(jié)果提示，白藜蘆醇能夠抑制ox-LDL刺激的血小板聚集，降低血小板ROS產(chǎn)生和PECAM-1表達(dá)，這些藥理作用與增加血小板Sirt1表達(dá)相關(guān)。

Fig 7 Effects of SB203580 on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

p38MAPK為MAPK家族的重要成員，不僅參與細(xì)胞的生存、分化和凋亡，還在炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)中起有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)［16］，白藜蘆醇可以抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，與p38MAPK通路有關(guān)。我們的結(jié)果顯示，抑制p38MAPK磷酸化能夠減少ox-LDL刺激血小板炎癥蛋白PECAM-1表達(dá)，但對ox-LDL誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生無明顯抑制作用。在生理?xiàng)l件下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為第二信使，參與細(xì)胞代謝，保持正常的細(xì)胞功能。然而，過高水平ROS能夠?qū)е录?xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，ROS也被認(rèn)為是氧化應(yīng)激反應(yīng)的病理產(chǎn)物和動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素［17－18］。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL刺激血小板之后，血小板發(fā)生聚集，ROS水平隨之升高，而白藜蘆醇部分地降低了ROS水平。由于細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的途徑較復(fù)雜，線粒體代謝、花生四烯酸代謝、nicotinamide adenine dinucleotide phos-phate（NADPH）等均是ROS的重要來源。我們的結(jié)果提示盡管白藜蘆醇減少ROS產(chǎn)生，但抑制效果

是不完全的，確切的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，白藜蘆醇能夠降低ox-LDL誘導(dǎo)的血小板聚集、減少ROS產(chǎn)生，并降低PECAM-1的表達(dá)。其分子機(jī)制與增加Sirt1的表達(dá)相關(guān)。此外，白藜蘆醇抑制PECAM-1表達(dá)與抑制p38 MAPK磷酸化相關(guān)。本研究提出了白藜蘆醇改善血小板功能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對臨床預(yù)防治療血栓性疾病，改善血管細(xì)胞功能具有重要的參考價(jià)值和科學(xué)意義。

（致謝：本文在北京老年醫(yī)學(xué)研究所免疫室完成，在此加以致謝！）

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Effect of resveratrol on ROS production and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

SUN Jie，SUN Wei-jia，CHEN Bei-dong，ZHAO Yan-yang，BAO Li，WU Wei，QI Ruo-mei （Beijing Hospital／Beijing Institute of Geriatrics，Beijing 100730，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of resveratrol on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets．Methods The expression of PE-CAM-1，Sirt1 and p38MAPK phosphorylation in ox-LDL-stimulated platelets was determined by Western blot．The level of ROS was measured by immunofluo-rescence kit．Results ox-LDL induced platelet aggre-gation by 14%，whereas resveratrol inhibited platelet aggregation by 50%．Resveratrol decreased ROS level by 3．2 fold and completely suppressed PECAM-1

expression in ox-LDL-treated platelets．Resveratrol re-covered Sirt1 expression in ox-LDL-treated platelets．EX527（a Sirt1 inhibitor）increased ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets．Meanwhile，resveratrol also suppressed p38MAPK phosphorylation induced by ox-LDL．Conclusion Resveratrol can inhibit platelet aggregation，decrease ROS production and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets．The mechanism maybe associated with recovery of Sirt1 expression．Moreover，resveratrol can decrease PECAM-1 expression，which may be linked to abolishing p38MAPK phosphorylation．

Key words：resveratrol；ox-LDL；platelets；ROS；PE-CAM-1；Sirt1；p38MAPK

作者簡介：孫 杰（1990－），女，碩士生，研究方向：心血管疾病相關(guān)的基礎(chǔ)研究，Tel：010-58115047，E-mail：cdmcsj＠126．com；齊若梅（1957－），女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)脈粥樣硬化、血栓學(xué)的分子機(jī)制，通訊作者，Tel：010-58115047，E-mail：ruomeiqi＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81270379，81471051）

收稿日期：2015－07－17，修回日期：2015－08－05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1608－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．025