黃天文，林智穎，陳曉春

（1．福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2．福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，福建福州 350001）

N-乙?；腚装彼釋?duì)Aβ25－35活化calpain活性的影響及可能機(jī)制

黃天文1，2，林智穎2，陳曉春1，2

（1．福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2．福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，福建福州 350001）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R322．8；R329．2；R341；R745．702．2；R977．4

摘要：目的 探討N-乙?；腚装彼幔∟-acetyl-L-cysteine，NAC）對(duì)β淀粉樣蛋白毒性片段25－35（Aβ25－35）活化cal-pain活性的影響及可能機(jī)制。方法 運(yùn)用Aβ25－35來(lái)誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、Aβ25－35組、NAC與Aβ25－35共同作用組，采用熒光酶標(biāo)法檢測(cè)calpain活性、氧自由基（H2O2）和線粒體膜電位；用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定神經(jīng)元內(nèi)ATP水平。結(jié)果 Aβ25－35（20 μmol·L－1）作用12 h可明顯升高calpain活性；與Aβ25－35處理組相比，NAC（10 mmol· L－1）預(yù)先作用24 h，然后再與Aβ25－35共同作用12 h，可明顯降低calpain活性；與空白對(duì)照組相比，Aβ25－35處理組中的H2O2明顯升高、線粒體膜電位和ATP水平明顯下降；而與Aβ25－35處理組相比，NAC預(yù)處理組中的H2O2水平下降、線粒體膜電位和ATP水平升高，這些差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 這些研究結(jié)果提示，NAC可能通過(guò)線粒體的保護(hù)作用來(lái)降低Aβ25－35誘導(dǎo)的異?；罨腸alpain活性。

關(guān)鍵詞：N-乙?；腚装彼幔籄β25－35；calpain；H2O2；線粒體膜電位；ATP

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．014．html

線粒體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）重要的病理?yè)p害，因此減輕線粒體的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有神經(jīng)保護(hù)功效［1－2］。雖然AD的發(fā)病機(jī)制目前仍然不是很清楚，但是Aβ的瀑布學(xué)說(shuō)仍為大部分學(xué)者所接受。其中Aβ片段25－35（Aβ25－35）是Aβ毒性的核心片段［3－4］。因此，運(yùn)用毒性片段Aβ25－35來(lái)干預(yù)神經(jīng)元可模擬AD樣的病理生化改變［3］，這為AD的研究提供了可靠的細(xì)胞模型。

N-乙?；腚装彼幔∟-acetyl-L-cysteine，NAC）

是常見的抗氧化劑。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25－35可增加Cdk5活性，從而增加tau蛋白的過(guò)度磷酸化［5］；而NAC可減輕Cdk5活性和tau蛋白磷酸化。所以，在我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)運(yùn)用毒性片段Aβ25－35（20 μmol·L－1）來(lái)誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元損害，然后探討NAC（10 mmol· L－1）對(duì)Cdk5上游信號(hào)calpain活性的影響。另外，線粒體功能受損可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高［6］，進(jìn)而激活calpain活性，所以我們測(cè)定與線粒體功能密切相關(guān)的指標(biāo)，如H2O2、線粒體膜電位和ATP。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1試劑 Aβ片段25－35、NAC均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自中國(guó)杭州江濱生物技術(shù)有限公司；胰酶、DMEM-F12培養(yǎng)基、左旋多聚賴氨酸、10×Hanks平衡鹽溶液、N2添加劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司?；A(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM-F12、青霉素G （0.1 IU·L－1）、NaHCO3（2 g·L－1）、HEPES（1.19 g·L－1）和鏈霉素（0.1 IU·L－1）。無(wú)血清培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋N2添加劑。完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋N2添加劑（DMEM-F12∶N2＝1∶1）＋10%胎牛血清。H2O2測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司；N-succinyl-leu-tyr-7-amido-4-methylcoumarin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）購(gòu)自Cell Technology公司；ATP測(cè)定試劑盒來(lái)自美國(guó)Roche公司。

1．1．2儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scientific公司）；熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；倒置顯微鏡（日本Olympus，CK40型）；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Berthold公司）。

1．1．3動(dòng)物 SD孕鼠［孕（18±2）d］清潔級(jí)，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1．2方法

參考文獻(xiàn)1．2．1胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng) （詳見［7］）：孕鼠麻醉后取出胎鼠，然后剔除腦膜及分離皮質(zhì)組織，再進(jìn)行消化、分離皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，最后計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)板上。前3 d使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后換成無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，這樣體外共培養(yǎng)6 d后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。 1．2．4熒光酶標(biāo)儀測(cè)定calpain活性 （詳見［5］）神經(jīng)元經(jīng)各種處理后，用calpain裂解液AS ［20 mmol·L－1Tris緩沖液pH 7.4，140 mmol·L－1氯化鈉，0．1%Nonidet-40（乙基苯基聚乙二醇）和蛋白酶抑制劑Cocktail SetⅢ］裂解；收集裂解液后，在4℃下以10 000×g速度離心10 min；取上清液、進(jìn)行蛋白定量；取20 μg蛋白置于96孔板中，同時(shí)加入calpain的作用底物130 μmol·L－1的N-succinyl-leu-tyr-7-amido-4-methylcoumarin，在30℃下避光孵育2 h。然后置于熒光酶標(biāo)儀中（激發(fā)波360 nm；發(fā)射波480 nm）測(cè)定熒光數(shù)值。最后，把所得到的熒光值與空白對(duì)照組比較。 1．2．5熒光酶標(biāo)儀測(cè)定H2O2［1］和H2O2試劑說(shuō)明書，用熒光方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2量。接種在96孔板的皮層神經(jīng)元，經(jīng)各種條件處理后，細(xì)胞暴露于含有50 μmol·L－1的Amplex Red reagent和0．1 kU·L－1辣根過(guò)氧化物酶（horse-radish peroxydase，HRP）作用60 min，選擇激發(fā)波540 nm和發(fā)射波590 nm，用多功能熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。 1．2．7ATP水平測(cè)定［1］和ATP試劑盒說(shuō)明書，用Roche公司的ATP Bioluminescenee Assay Kit HSII檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。各組細(xì)胞用0.25%胰酶消化后收集，用ATP試劑盒中的溶解緩沖液（dilution buffer）將各組細(xì)胞數(shù)量調(diào)至107· L－1，之后加入ATP試劑盒中的細(xì)胞裂解試劑（cell lysis reagent）于15℃～25℃條件下作用5 min，最后加入等體積的熒光（素）酶試劑（luciferase reagent），用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，比較不同組細(xì)胞內(nèi)ATP水平。

1．2．2凝聚態(tài)Aβ25－35的制備［8］用超純水溶解Aβ25－35，配成1 mmol·L－1；然后儲(chǔ)存于－20℃。在Aβ25－35使用前，將Aβ25－35融化并且置于37℃環(huán)境，總共孵育4 h。這樣使得單體的Aβ25－35凝聚成凝聚態(tài)狀態(tài)。

1．2．3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組 ①空白對(duì)照組：未給予干預(yù)處理。②Aβ25－35組：20 μmol·L－1的Aβ25－35作用12 h。③NAC預(yù)處理組：先給予10 mmol·L－1的NAC作用24 h，然后給予20 μmol·L－1的Aβ25－35共同作用12 h。

1．2．6線粒體膜電位測(cè)定 使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）來(lái)檢測(cè)線粒體的膜電位。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書及參考文獻(xiàn)［1］，簡(jiǎn)要步驟如下：神經(jīng)元經(jīng)不同處理后，經(jīng)胰酶消化后、洗滌。取相同數(shù)目的神經(jīng)元，加入JC-1溶液，于37℃孵育15 min；然后洗滌多余的JC-1試劑，加入等體積的分析液，最后使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。所得的熒光強(qiáng)度比值反映線粒體內(nèi)、外膜電位差：紅色熒光強(qiáng)度（exλ550nm，emλ600nm）／綠色熒光強(qiáng)度（exλ485nm，emλ535nm）。

1．2．8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以圖、數(shù)據(jù)表示。采

用SPSS 10．0軟件進(jìn)行單因素方差分析進(jìn)行組間比較分析，所得的值以±s（standard error of the mean）表示。

推薦理由:這是一本引自美國(guó)的經(jīng)典服裝類版權(quán)圖書，藝術(shù)與技術(shù)交相輝映。本書從立體裁剪基本原理入手，詳細(xì)講解了基本款式、系列款式、變化款式的立體裁剪技法及應(yīng)用，以期為廣大愛好服裝藝術(shù)的讀者在原創(chuàng)作品和專業(yè)技術(shù)上提供指導(dǎo)和啟發(fā)。

2　結(jié)果

2．1皮層神經(jīng)元的培養(yǎng) 胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)了6 d后，擬進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。如Fig 1所示，光鏡下培養(yǎng)了6 d的皮層神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體立體感明顯，突起廣泛接觸，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

Fig 1 Morphology of cortical neurons for 6 d under inverted microscope（×400）

2．2NAC對(duì)calpain活性的影響 本實(shí)驗(yàn)用Aβ25－35作用皮層神經(jīng)元12 h，然后測(cè)定神經(jīng)元內(nèi)calpain活性。結(jié)果如Fig 2所示，與空白對(duì)照組相比較，神經(jīng)元在Aβ25－35作用12 h后，calpain活性明顯升高，這說(shuō)明Aβ25－35可誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)calpain活性升高。為了研究NAC對(duì)神經(jīng)元內(nèi)calpain活性的影響，我們先給予10 mmol·L－1的NAC作用于皮層神經(jīng)元24 h，然后與20 μmol·L－1的Aβ25－35共同作用12 h，最后測(cè)定神經(jīng)元內(nèi)calpain活性。結(jié)果顯示，與Aβ25－35組相比較，NAC預(yù)先孵育組的神經(jīng)元內(nèi)calpain活性明顯下降，且NAC預(yù)先孵育組的cal-pain活性與空白對(duì)照組中calpain活性水平接近。這提示了NAC可減輕Aβ25－35升高calpain活性的作用。

2．3NAC減輕Aβ25－35誘導(dǎo)的H2O2升高 H2O2是氧自由基的重要組成部分，我們運(yùn)用熒光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的H2O2水平。如Fig 3所示，與空白對(duì)照組相比較，20 μmol·L－1的Aβ25－35作用12 h后，神經(jīng)元的H2O2熒光值水平明顯升高；10 mmol·L－1的NAC預(yù)先孵育24 h，再與20 μmol·L－1Aβ25－35作用12 h，細(xì)胞內(nèi)的H2O2明顯下降。

2．4NAC對(duì)神經(jīng)元線粒體膜電位的影響 線粒體膜內(nèi)外的電位差是線粒體維持自身功能的需要。當(dāng)這種電位差下降，提示線粒體功能的下降。所以，測(cè)定線粒體膜電位是反映線粒體功能的一個(gè)重要指標(biāo)。如Fig 4所示，神經(jīng)元經(jīng)Aβ25－35作用12 h后，線粒體膜電位就明顯下降，這提示線粒體功能下降；另外，先經(jīng)NAC預(yù)先孵育24 h后，再與Aβ25－35共同作用12 h后，相對(duì)于Aβ25－35組，線粒體膜電位則明顯升高，提示線粒體功能有所改善。

Fig 2 NAC attenuated increase of calpain activity induced by Aβ25－35（±s，n＝3）

Fig 3 NAC decreased H2O2level in primary cortical neurons treated with Aβ25－35（±s，n＝3）

2．5NAC對(duì)神經(jīng)元ATP水平的影響 ATP是線粒體產(chǎn)生的，因此ATP的水平也反映線粒體的功能狀態(tài)。由Fig 5可見，與空白對(duì)照組相比較，Aβ25－35作用后ATP的水平明顯下降。這也提示Aβ25－35可

抑制線粒體功能。然而，與Aβ25－35組相比較，NAC預(yù)先孵育后，再與Aβ25－35共同作用組中，ATP水平有一定程度的升高。這說(shuō)明NAC具有保護(hù)線粒體功能的作用。

Fig 4 NAC attenuated decreasing of neuronal mitochondrial membrane potential induced by Aβ25－35（±s，n＝3）

Fig 5 NAC increased ATP level（±s，n＝3）

3　討論

根據(jù)前期的研究基礎(chǔ)，我們?nèi)匀焕^續(xù)使用20 μmol·L－1的Aβ25－35作用于皮層神經(jīng)元12 h［8］，然后測(cè)定calpain活性。同樣根據(jù)我們的前期研究，我們選擇預(yù)先用10 mmol·L－1的NAC孵育24 h，然后與20 μmol·L－1的Aβ25－35共同作用12 h的方式來(lái)探討NAC的可能作用。

我們使用熒光法測(cè)定calpain活性，研究發(fā)現(xiàn)NAC可降低Aβ25－35誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)calpain活性的水平。那么，NAC是通過(guò)什么途徑來(lái)降低calpain的活性？大量研究證明，無(wú)論是AD患者或是Aβ的毒性損害，神經(jīng)元內(nèi)的線粒體皆有不同程度受損，并且有大量的氧自由基的堆積、線粒體膜電位下降和細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯下降。這些細(xì)胞內(nèi)的改變和線粒體損害是一致的。

正常細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。但是，維持這種鈣離子的濃度差是需要ATP參與的。當(dāng)線粒體功能受損，ATP生成受阻。當(dāng)產(chǎn)生的ATP不足以維持鈣離子濃度差的時(shí)候，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度就會(huì)不斷升高。升高的鈣離子濃度反過(guò)來(lái)激活鈣依賴的蛋白激酶（如calpain）［11－12］，從而使得細(xì)胞損害進(jìn)一步加劇，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。另外，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能進(jìn)行相互影響，線粒體功能異?？捎绊懙絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，加劇細(xì)胞鈣離子濃度的紊亂［12］。所以，保護(hù)線粒體功能，能夠維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，抑制鈣依賴的蛋白激酶calpain活性升高，保護(hù)神經(jīng)元。

因此，為了能比較全面檢測(cè)線粒體的功能，我們測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)的H2O2水平和線粒體膜電位及神經(jīng)元內(nèi)的ATP水平。結(jié)果提示，Aβ25－35作用12 h，線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)的ATP水平明顯下降，而細(xì)胞內(nèi)的H2O2明顯升高；而NAC預(yù)先孵育后的神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜電位和ATP水平是有所升高的，H2O2則明顯下降。這些結(jié)果提示NAC可保護(hù)線粒體，提高細(xì)胞內(nèi)的ATP水平。

綜上所述，Aβ25－35可損害細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能、降低ATP水平、激活calpain活性；而NAC可改善線粒體功能、增加ATP的水平、減輕異常激活的calpain的活性。這些研究可為抗氧化劑治療AD提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Possible effect of N-acetyl-L-cysteine on Aβ25－35-induced increase of calpain activity

HUANG Tian-wen1，2，LIN Zhi-ying2，CHEN Xiao-chun1，2
（1．Dept of Neurology，2．Fujian Institute of Geriatrics，F(xiàn)ujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China）

Abstract：Aim To explore the effect of N-acetyl-L-cysteine（NAC）on β amyloid peptide 25－35 （Aβ25－35）-induced the increase of calpain activity and its possible mechanism．Methods The activity of cal-pain was induced by 20 μmol·L－1Aβ25－35in primary cortical neuron．Neurons were incubated in the absent or present Aβ25－35，or pre-incubated NAC（10 mmol ·L－1），then co-incubated with Aβ25－35．The meas-urement of calpain activity，H2O2level and mitochon-drial membrane potential was performed on a micro-plate fluorometer．The ATP level was detected using a luciferin／luciferase based ATP assay kit．Results In Aβ25－35treated group，the activity of calpain and H2O2was obviously higher than that in control group．How- ever，in neurons pre-incubated in NAC and then co-in-cubated in Aβ25－35，the calpain activity and H2O2level were significantly decreased compared with that in Aβ25－35group．Upon Aβ25－35exposure for 12 h，corti-cal neurons showed a significant decrease in mitochon-drial membrane potential and ATP level when com-pared to the control group．Pre-treatment with NAC showed an increase in mitochondrial membrane poten-tial and ATP level as compared to neurons treated with Aβ25－35alone for 12h．Conclusion This result sug-gests that NAC can attenuate calpain activity induced by Aβ25－35through protecting mitochondria．

Key words：N-acetyl-L-cysteine；Aβ25－35；calpain；H2O2；mitochondrial membrane potential；ATP

作者簡(jiǎn)介：黃天文（1978－），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：卒中和癡呆臨床與基礎(chǔ)，E-mail：huangtianwen2002＠126．com；林智穎（1972－），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：老年性癡呆基礎(chǔ)和臨床，通訊作者，E-mail：lzy8426＠126．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81100812）；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2013J01311）；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（No 2012-CX-15）

收稿日期：2015－08－23，修回日期：2015－09－27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1505－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．007