賈 馨 媛，閆 磊，祖 國 仁

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

褐藻酸是從褐藻加堿提取出來的一種水溶性高黏度膠體，為各種褐藻所共同含有的一種細(xì)胞間多糖［1］。近年來，隨著對褐藻酸的深入研究，發(fā)現(xiàn)褐藻酸的降解產(chǎn)物——褐藻寡糖具有良好的生物活性［2］，在生物材料、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域展現(xiàn)了頗有前景的商業(yè)價值。褐藻寡糖具有抗癌、抗腫瘤、促進(jìn)植物根系生長等多種生理功能。褐藻寡糖的眾多制備方法中酶解法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，具有底物特異性高、反應(yīng)條件易控制、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。褐藻酸裂解酶來源廣泛，但由于分離純化困難、酶產(chǎn)量低等因素制約了實(shí)際生產(chǎn)利用的發(fā)展［3］，因此研究褐藻酸降解菌具有重要的意義。

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對一株褐藻酸降解菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為日后大規(guī)模生產(chǎn)褐藻酸裂解酶和后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 試 驗(yàn)

1.1 材 料

褐藻酸降解菌ZGR－13，大連金石灘海域的近海海帶養(yǎng)殖場中腐爛的病株海帶中分離得到。

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏0.1%、FeSO40.5%、NaCl 3.0%、褐藻酸鈉0.5%、pH 7.2～7.5。斜面培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂粉。

1.2 方 法

1.2.1 酶活力的測定

采用DNS法檢測酶活力。

酶活力單位（U）定義：在波長為520nm 處每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量。

比活力（U／mL）：每毫升發(fā)酵液所含的酶活力單位。

酶活力（U／mL）＝1 000mN／tV

式中：m為還原糖量（根據(jù)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得），g；N為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間，15 min；V為酶液體積，0.2mL［4］。

1.2.2 菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將菌株接入裝有5 mL 液體種子培養(yǎng)基的試管中，在25 ℃、150r／min搖床中培養(yǎng)24h，再接入裝有30 mL液體培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中，在25 ℃、150r／min搖床中培養(yǎng)一定時間，4 ℃、8 000r／min離心15min，取上清液，用DNS法測酶活力。

1.2.3 Plackett－Burman法分析影響菌株產(chǎn)酶的顯著因素

利用Plackett－Burman法對各因素進(jìn)行考察［5］。每個因素選取兩水平，響應(yīng)值為酶活力（Y）［6］。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett－Burman試驗(yàn)找到關(guān)鍵因素由試驗(yàn)結(jié)果擬合得到一階模型回歸系數(shù)的符號和大小確定因素水平的增減，逼近酶活最高區(qū)域［7］。

1.2.5 Box－Behnken設(shè)計及響應(yīng)面分析

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，借助 Design expert 6.0軟件［8］進(jìn)行Box－Behnken 設(shè)計，建立有效響應(yīng)曲面擬合方程并分析結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對培養(yǎng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化。最終通過優(yōu)化試驗(yàn)獲得的試驗(yàn)結(jié)果與模型進(jìn)行擬合，驗(yàn)證模型的可靠性［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett－Burman確定影響產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素

確定Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計的因素及水平，以測得的粗酶液的酶活平均值為響應(yīng)值Y，選擇培養(yǎng)基的碳源、氮源、混合碳源、酵母膏含量、FeSO4、NaCl、接種量、裝液量八因素作考察對象，Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值見表1和2。

表1 試驗(yàn)因素與水平Tab.1 List of levels and factors

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計Tab.2 Design of Plackett－Burman experiment

表3為單因素方差分析，由表3可以看出，該模型的p值為0.045 4，說明篩選模型顯著，僅有4.54%的概率不能使用該模型解釋。利用Plackett－Burman設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)條件的重要因素具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過p值可以看出，對產(chǎn)酶有顯著作用的有2個因素（p≤0.05）：氮源添加量與酵母膏添加量。據(jù)已選的Plackett設(shè)計試驗(yàn)因素組合和試驗(yàn)組數(shù)如表2所示。

表3 單因素方差分析Tab.3 Analysis of selected factorial model

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

以玉米漿（X1）、酵母膏（X2）為自變量，酶活力為因變量。由表4可知，酶活力最高點(diǎn)在試驗(yàn)4和試驗(yàn)5之間。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計Tab.4 The design and results of steepest ascent test

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

根據(jù)表4試驗(yàn)結(jié)果，第4組與第5組數(shù)據(jù)取平均值進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，設(shè)計因素與水平及中心組合試驗(yàn)設(shè)計如表5和6所示。

表5 試驗(yàn)因素與水平Tab.5 List of levels and factors

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計Tab.6 Design and result of CCD

由軟件分析得模型的擬合度（R2）＝0.902 8，說明該模型在90%水平上能夠擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。模型的信噪比為8.029，一般模型信噪比大于4模型較好，CV值（%）較低，為7.9，說明試驗(yàn)操作可信度較高。得到回歸方程：Y＝0.25＋0.020X1＋0.012X2＋0.020X1X2－0.029X2－0.034X2變量系數(shù)為正值，表示該變量正向變化可使得響應(yīng)值增加；二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，表示方程的拋物面開口沖下，有極大值點(diǎn)，可以進(jìn)行最優(yōu)分析。響應(yīng)面分析結(jié)果見表7，響應(yīng)曲面圖可預(yù)測檢測變量的響應(yīng)值與確定變量的相互作用形式如圖1所示。

表7 交互因素方差分析Tab.7 ANOVA for response surface quadratic model

圖1 玉米漿（X1）和酵母膏（X2）對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.1 Effects of yeast extract and corn steep liquor on enzyme production

2.4 最佳產(chǎn)酶條件

最優(yōu)回歸方程求偏導(dǎo)數(shù)得出酶活力達(dá)最大值時X1＝1.85，X2＝0.92，即條件為氮源1.85%，酵母膏0.92%，褐藻酸鈉0.4%，NaCl 3%，F(xiàn)eSO40.01%，混合碳源3%，接種量9%，裝液量30mL，試驗(yàn)得到最大酶活57.61U／mL。

3 結(jié) 論

褐藻酸降解菌的開發(fā)和應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)海洋資源高值化應(yīng)用的一項(xiàng)核心技術(shù)。本研究通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了該株褐藻酸降解菌ZGR－13的最適培養(yǎng)條件。在最適條件下，菌株的最大酶活理論上可達(dá)57.61U／mL。本研究有效篩選出了主要的影響因素，避免了非主要因素可能帶來的時間和資源浪費(fèi)，為褐藻酸酶的分離純化及制備酶解產(chǎn)物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。目前，國際市場上商品化的褐藻酸裂解酶制劑及其降解產(chǎn)物仍然空白。隨著研究的深入，褐藻酸降解菌在新藥開發(fā)、新型功能產(chǎn)品及新生化制品的研制將發(fā)揮重要作用。

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