崔 美 蘭，劉 金 鳳，黃 忠 剛，肖 珊，王 晗，王 際 輝

（1.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.大連博仕奧生物科技有限公司，遼寧 大連 116085）

0 引 言

人類對微生物的利用經(jīng)歷了天然混合培養(yǎng)到純種培養(yǎng)2個階段［1］，但是，在長期的實驗和生產(chǎn)實踐中，人們不斷地發(fā)現(xiàn)很多重要生化過程是單株微生物不能完成或只能微弱進行，必須依靠2種或多種微生物共同培養(yǎng)完成。因此，微生物混合培養(yǎng)（Mixed culture）或混合發(fā)酵（Mixed fermentation）越來越被人們重視。

混合發(fā)酵一般是指2種或2種以上微生物共同進行發(fā)酵的過程［2］。當把幾種微生物一起混合發(fā)酵時，可以獲取某些純種無法得到的產(chǎn)物或提高產(chǎn)率［3］、提高活菌數(shù)［4］、縮短發(fā)酵周期、節(jié)省生產(chǎn)成本［5］等。魏嵬等［6］采用纖維素降解菌、木聚糖降解菌和木質素降解菌3種菌對秸稈進行混菌發(fā)酵產(chǎn)還原糖，提高了秸稈利用率。彭維等［7］利用雙歧桿菌與乳酸桿菌在100L發(fā)酵罐中進行混合培養(yǎng)，活菌數(shù)達到1.0×109cfu／mL，可以滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)畜用益生菌的要求。范金霞等［8］研究發(fā)現(xiàn)利用4種纖維素降解菌混合發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶活力要優(yōu)于每一單菌發(fā)酵的酶活力。

微生物混合發(fā)酵廣泛應用于食品行業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和開發(fā)新能源方面。1982年，由日本琉球大學比嘉照夫教授研究出的EM 菌就是一個成功的例子，該研究成果廣泛應用于各行業(yè)，包括水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)?；旌习l(fā)酵有廣闊的發(fā)展空間，在工業(yè)發(fā)酵中如果得以合理運用，就可以提高生產(chǎn)效率與產(chǎn)品質量，為實現(xiàn)綠色無污染生產(chǎn)提供新的發(fā)酵模式［9］。從現(xiàn)有的菌劑來看，存在多菌種菌劑品種較少、菌劑廣譜性能較差等問題［10］。為此，本實驗利用混菌之間共生和互補的營養(yǎng)作用，通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方和多菌種的共同培養(yǎng)條件，確定菌株發(fā)揮最大協(xié)同作用的結合點，克服發(fā)酵過程中的不利影響，從而提高發(fā)酵效果，同時簡化發(fā)酵設備，提高設備利用率。本實驗采用9株農(nóng)業(yè)部公告第1126號（2008）中允許作為飼料添加劑的有益菌，通過混合發(fā)本地的方法制備EM 菌劑，最終得到高菌數(shù)、無公害、廣譜性能較佳的微生態(tài)制劑。

1 材料與方法

1.1 菌 株

混合發(fā)酵制備微生態(tài)制劑的菌種包括芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌和光合細菌。其中，芽孢桿菌包括BS1、BS2、DSM5和ML9 4 株菌；酵母菌為SC2；乳酸菌包括EF2、PP2和LP 3株菌；光合細菌為PT－obt，以上菌種均為實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子液培養(yǎng)基

采用LB肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌和光合細菌；采用YPD 培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌；采用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌。

1.2.2 斜面培養(yǎng)基

固體斜面培養(yǎng)基是種子液培養(yǎng)基的基礎上添加15～20g瓊脂制備而成。

1.2.3 初始發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，牛肉膏10g，酵母膏10g，KH2PO40.15g，K2HPO40.15g，MgSO40.15g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，MnSO40.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000mL，自然pH。

1.2.4 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

1.2.4.1 碳 源

將4個菌種的種子液按1∶1∶1∶1（總量為9%）的比例接種到碳源分別為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜和麥芽糖的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180r／min，光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，采用稀釋涂布平板法測定活菌數(shù)［11］，確定最佳碳源。

1.2.4.2 氮 源

最佳碳源確定后，將4個菌種的種子液按1∶1∶1∶1（總量為9%）的比例接種到氮源分別為蛋白胨、牛肉膏、尿素、硝酸銨和黃豆粉的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180r／min，光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，采用稀釋涂布平板法測定活菌數(shù)，確定最佳氮源。

1.2.4.3 正交試驗

將單因素篩選出的最佳碳源和氮源按L9（34）正交表進行進一步試驗，正交因素及水平如表1所示。

表1 碳源、氮源正交設計表Tab.1 Orthogonal design of carbon and nitrogen source g／L

1.2.4.4 無機鹽

確定最佳碳源和氮源以后，將4個菌種的種子液按1∶1∶1∶1（總量為9%）的比例，接種于去除了某種無機鹽［12］如乙酸鈉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃，180r／min，光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，采用稀釋涂布平板法測定活菌數(shù)，從而確定必需的無機鹽組分。

1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

對接種量（1%，2%，3%，5%，9%）、接種順序（1－同時接菌；2－乳酸菌→光合細菌→芽孢桿菌→酵母菌；3－光合細菌→乳酸菌→芽孢桿菌→酵母菌）、初始pH（5.0～7.0）、裝液量（25～100mL）、轉速（100～200r／min）以及溫度（20～30 ℃）進行優(yōu)化。

1.2.6 生長曲線測定

混合發(fā)酵生長曲線測定采用分光光度計法［13］，測定混合發(fā)酵菌液在600nm 處的吸光度OD600。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013軟件處理，所用數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值±標準誤差值。

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化結果

2.1.1 碳 源

從圖1可以看出，當碳源為可溶性淀粉或葡萄糖時，最終有效活菌數(shù)比其他碳源高，能達到2.8×109和2.3×109cfu／mL。這可能是因為在混合培養(yǎng)過程中，有些菌株如芽孢桿菌分泌胞外淀粉酶［14］，將淀粉水解成了葡萄糖，提供了更多的碳源供自己或其他菌種使用。不僅如此，可溶性淀粉或葡萄糖都屬于較廉價的碳源，因此，選擇可溶性淀粉和葡萄糖為最佳碳源。

圖1 碳源優(yōu)化結果Fig.1 Results of carbon optimization

2.1.2 氮 源

從圖2可以看出，有機氮源的利用率比無機氮源的高，可能是因為有些菌株產(chǎn)生了蛋白酶，使蛋白胨、牛肉膏等有機氮源水解為更容易被利用的小分子化合物［15］。何華美等［16］考察了多種芽孢桿菌在其優(yōu)化的工藝條件下混菌發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶能達到2 986 U／mL。不僅如此，有機氮源中，利用率由高到低的順序為蛋白胨，牛肉膏，黃豆粉。雖然使用牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基活菌數(shù)比黃豆粉高，但是由于牛肉膏成本過高，因此選擇蛋白胨和黃豆粉為最佳氮源。

圖2 氮源優(yōu)化結果Fig.2 Results of nitrogen optimization

2.1.3 正交試驗

根據(jù)“2.1.1”和“2.1.2”的結果，對混合發(fā)酵最佳組分進行L9（34）正交試驗，結果見表2。從表2可以看出，影響混合發(fā)酵結果的主次順序為葡萄糖、蛋白胨、黃豆粉、可溶性淀粉。最佳混合培養(yǎng)基組合為：A2B1C3D3。綜合考慮各因素對各菌種生長的影響結果，最終確定培養(yǎng)基組合為A2B1C2D3。

表2 正交試驗優(yōu)化結果Tab.2 Results of orthogonal test

2.1.4 無機鹽

選擇以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，考察培養(yǎng)基配方中鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽等無機鹽添加與否對菌株生長的影響，結果見圖3。如圖3所示，去除某一種無機鹽對菌株的生長都有影響。其中分別去除KH2PO4和CaCl2以后，活菌數(shù)比基礎培養(yǎng)基的活菌數(shù)都高，而去除其他任意一種無機鹽時，都影響了菌株的生長。因此，確定基礎培養(yǎng)基中去除KH2PO4和CaCl2這兩種無機鹽。

圖3 無機鹽優(yōu)化結果Fig.3 Results of inorganic salts optimization

2.2 培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化結果

2.2.1 溫 度

將4個菌種的種子液按9%的比例，接種于最佳培養(yǎng)基當中，分別在20，25，30，35℃，180r／min、光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，測定活菌數(shù)結果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著溫度的升高，混合發(fā)酵活菌數(shù)越高，當25℃時，活菌數(shù)最高，能達到1.8×109cfu／mL。當溫度超過30 ℃時，活菌數(shù)反而下降，可能是因為隨著溫度的升高，有些菌株生長過快提前進入衰亡期，影響了菌株的生長周期［17］，使得混菌發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)降低。因此選擇25 ℃為最佳混合發(fā)酵溫度。

2.2.2 轉 速

將4個菌種的種子液按9%的比例，接種于最佳培養(yǎng)基當中，分別在100，120，140，160，180和200r／min，25 ℃光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，測定活菌數(shù)結果如圖5所示。從圖5可以看出，隨著轉速的升高，活菌數(shù)也隨之升高，在180r／min時達到最高，但超過180r／min時反而降低。這可能是因為隨著轉速升高，混合發(fā)酵液中溶解氧增多，使需氧菌和厭氧菌對氧氣的需求達到一種動態(tài)平衡狀態(tài)，因此180r／min時菌數(shù)達到最高；而超過180r／min時，發(fā)酵液內(nèi)溶解氧過多，導致對厭氧菌生長產(chǎn)生了抑制作用，因此活菌數(shù)呈降低趨勢。因此選擇180r／min為最佳培養(yǎng)轉速。

圖5 轉速優(yōu)化結果Fig.5 Results of rotation rate optimization

2.2.3 接種量

將4個菌種的種子液按1%，2%，3%，5%，9%接種于最佳培養(yǎng)基當中，在25 ℃、180r／min、光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，測定活菌數(shù)，結果如圖6所示。從圖6可以看出，接種量不同，混合發(fā)酵活菌數(shù)不同，且以3%接種時活菌數(shù)最高，能達到2.0×109cfu／mL。

圖6 接種量優(yōu)化結果Fig.6 The optimization of inoculum dose

2.2.4 初始pH

將4個菌種的種子液按3%的比例接種于初始pH 分別為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0的最佳培養(yǎng)基當中，在25 ℃、180r／min、光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，測定活菌數(shù)結果如圖7所示。從圖7可以看出，當pH 為5.0～6.5時，發(fā)酵出的活菌數(shù)并沒太多差異，在pH 7.0 時最高，達到1.91×109cfu／mL。因此選擇發(fā)酵初始pH 為7.0。

圖7 初始pH 優(yōu)化結果Fig.7 The optimization of initial pH

2.2.5 接種順序

將4個菌種的種子液按3%的比例，按照指定接種順序接種于初始pH 為7.0的最佳培養(yǎng)基中，在25 ℃、180r／min、光照條件下振蕩培養(yǎng)48h，測定活菌數(shù)無明顯差異，因此為了減少接菌過程中染菌概率及方便操作，選擇同時接菌的方式進行接種。

2.3 生長曲線測定結果

將各菌種種子液按照3%接種于最佳培養(yǎng)基中，在25℃、180r／min、通氣量為10L／min、光照條件下，每3h測定一次600nm 處的吸光度，繪制的生長曲線如圖8所示。從圖8中可以看出，混合發(fā)酵菌種在12h時達到對數(shù)生長期的最高峰，而后一直保持穩(wěn)定生長狀態(tài)，且無下降趨勢。這可能是因為混合發(fā)酵過程中某些菌種之間形成了一種菌的代謝產(chǎn)物成為另一種菌的培養(yǎng)基的互利共生的關系，從而延長了混合發(fā)酵的穩(wěn)定期［18－19］。

圖8 混合發(fā)酵菌體生長曲線Fig.8 The growth curve of mixed fermentation

微生物混合發(fā)酵越來越受人們重視，應用混合發(fā)酵技術為人們解決實際問題已經(jīng)成為一種趨勢，如開發(fā)清潔新能源，生產(chǎn)單細胞蛋白，用于生物降解和生產(chǎn)藥品等［20－21］。但從當前的研究報道來看，微生物混合發(fā)酵研究更多地局限于工藝的優(yōu)化，而對菌種與菌種之間的協(xié)同作用機理研究較少，對于生產(chǎn)缺乏有效的理論指導。因此，混菌發(fā)酵過程中菌種間的作用機理也是今后研究工作的重點。

3 結 論

混合培養(yǎng)制備EM 菌的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10g／L，可溶性淀粉15g／L，蛋白胨10g／L，酵母膏2.5g／L，乙酸鈉5g／L，檸檬酸三銨2g／L，K2HPO40.15 g／L，MgSO40.2 g／L，MnSO40.05g／L，吐溫80 1mL，蒸餾水1L。在此培養(yǎng)基基礎上，按照接種量3%（各菌種體積比1∶1∶1∶1）同時接菌，在25 ℃、初 始pH 7.0、180r／min條件下，得到菌液活菌數(shù)為4.4×109cfu／mL，是發(fā)酵前的2倍。

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