曹 照 平，周 廣 麒，楊 吉 祥，武 博，金 美 芳，王 亞 芳

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

Cordycepin（蟲草素，即3′－脫氧腺苷），又名蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）菌素，是一種細(xì)胞毒性試劑和腺苷的結(jié)構(gòu)類似物［1］，能抑制枯草桿菌、鳥結(jié)核桿菌、炭疽桿菌、豬出血性敗血癥桿菌等病原菌的生長，尤以對枯草桿菌的抑制作用最強(qiáng)［2－3］。但Cordycepin 在C.militaris中的含量很低，傳統(tǒng)的選育方法為原生質(zhì)體紫外輻射和吖啶橙、亞硝基胍等理化因子誘變［4－6］，新興的方法有離子注入、近紅外光譜法誘變［7］等。李文等［8］利用低能離子束修飾C.militaris菌株提高Cordycepin產(chǎn)量。Das等［9］利用高能離子束輻照方法，篩選得到8－氮鳥嘌呤抗性突變株C.MilitarisG81－3，使發(fā)酵液中Cordycepin的產(chǎn)量達(dá)到3.1g／L，比出發(fā)菌株提高了72%。本研究通過超聲波聯(lián)合硫酸二乙酯（DES）復(fù)合誘變C.militaris菌，針對性的篩選黃嘌呤和鳥嘌呤雙重營養(yǎng)缺陷型（Xan－＋Gua－）株，其Cordycepin產(chǎn)量與親株相比明顯提高，為Cordycepin的規(guī)?；a(chǎn)提供有力的理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

CordycepsmilitarisFFCC5111，大連工業(yè)大學(xué)食品發(fā)酵微生物菌培養(yǎng)與保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基：硝酸鈉3g／L，磷酸氫二鉀1g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，氯化鉀0.5g／L，蔗糖30g／L，瓊脂20g／L，補(bǔ)足水至1 000mL。

活化培養(yǎng)基：葡萄糖40g／L，酵母粉10g／L，Xanthine 0.1g／L，Guanine 0.1g／L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ：取馬鈴薯200g→去皮→切碎→加水煮沸→濾液，加入葡萄糖20g，維生素B110mg，加水至1 000mL，pH 自然。固體培養(yǎng)需加入瓊脂20g。

發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ：葡萄糖40g／L，酵母粉15g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，K2HPO4·3H2O 0.5g／L，KH2PO40.5g／L，Guanosine 0.1g／L。

補(bǔ)充培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中添加Xanthine 100μg／mL和Guanine 100μg／mL，pH 7.0。

1.1.3 試 劑

Xanthine，Guanine，Guanosine，Cordycepin標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司。

1.1.4 主要儀器和設(shè)備

UV－5200紫外分光光度計(jì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空冷凍干燥機(jī)，MJL07－5超聲－微波反應(yīng)器，MJ33萬分之一電子天平，搖瓶／振蕩機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單孢子懸液的制備

將C.MilitarisFFCC5111菌種轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中，26 ℃、160r／min搖瓶培養(yǎng)6d，無菌過濾，濾取孢子，制備單孢子［10］懸液，無菌生理鹽水稀釋使孢子濃度為106～107個(gè)／mL。

1.2.2C.militaris的誘變

1.2.2.1 超聲波誘變條件的確定

超聲波功率為200 W，22kHz。將單孢子懸液置于冰水浴中，經(jīng)過超聲波誘變處理60 min后，從中吸取菌液0.1 mL 涂布于完全培養(yǎng)基凝固平板中，26 ℃培養(yǎng)7d，檢查培養(yǎng)平板中的單菌落數(shù)，計(jì)算致死率，并確定超聲波誘變的時(shí)間。同時(shí)做對照試驗(yàn)。

致死率＝（A－B）／A×100%

式中：A為未經(jīng)超聲波誘變的對照平皿中的單菌落數(shù)；B為經(jīng)超聲波誘變后平皿中的單菌落數(shù)。

1.2.2.2 DES誘變條件的確定

用無菌的磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液，0.1mol／L，pH 7.0），梯度稀釋單孢子懸液至10－1，10－2，10－3和10－4倍，分別加入DES溶液使體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1%，振蕩誘變45min。吸取1mL各稀釋度誘變菌液至試管中，加入硫代硫酸鈉溶液（250g／L）0.5mL 終止反應(yīng)，再從中吸取0.1 mL 涂布于完全培養(yǎng)基凝固平板上，26 ℃培養(yǎng)到第7 天，檢查培養(yǎng)平板中的單菌落數(shù)，計(jì)算致死率，并確定DES誘變的時(shí)間。

1.2.2.3 復(fù)合誘變

取稀釋度為10－3倍的單孢子懸液8 mL，加入磷酸鹽緩沖液和DES溶液，在冰水浴中先后進(jìn)行超聲波和DES 交替復(fù)合誘變處理，并從0～60min選擇最佳的誘變時(shí)間，使得涂于培養(yǎng)平板中基本培養(yǎng)基上的細(xì)胞致死率為75%～90%。

1.2.3 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選

1.2.3.1 缺陷型的檢出

吸取1mL 誘變液倒入基本培養(yǎng)基中混勻，制成夾層培養(yǎng)基平板（夾層培養(yǎng)基平板共有3層，自下至上依次為不含菌的基本培養(yǎng)基、混有誘變菌液的基本培養(yǎng)基、不含菌的基本培養(yǎng)基）。26 ℃培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落作標(biāo)記，然后再向皿內(nèi)倒入一層（第4層）補(bǔ)充培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)后，長出的形態(tài)較小的新菌落，即為疑似Xan－和Gua－營養(yǎng)缺陷型突變株［11］。

1.2.3.2 缺陷型的驗(yàn)證

將疑似Xan－和Gua－營養(yǎng)缺陷型突變株依次接種在基本培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基＋Xanthine、基本培養(yǎng)基＋Xanthine＋Guanine上，僅在后者長出的菌就是Xan－和Gua－雙重營養(yǎng)缺陷型菌株［12］。

1.2.3.3 高產(chǎn)Cordycepin菌株的獲得

作為次生代謝產(chǎn)物的Cordycepin 具有抗菌作用［2－3］。將獲得的Xan－＋Gua－雙重營養(yǎng)缺陷型突變株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中，160r／min、26 ℃搖瓶培養(yǎng)6 d。通過冷凍干燥法制備Cordycepin試樣。將指示菌B.subtilis懸液均勻涂于細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，取10μL Cordycepin樣液于直徑0.4cm 的濾紙片上，放在指示菌平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀測各個(gè)突變株對B.subtilis生長的抑菌圈，評定Cordycepin的生產(chǎn)能力。

1.2.3.4 復(fù) 篩

在100 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中接種10%，160r／min、26 ℃培養(yǎng)16d，期間從第6天開始檢測生物量、葡萄糖含質(zhì)量濃度Cordycepin 生成量，最終選定高產(chǎn)菌株。

1.2.4 Cordycepin的提取及檢測

將發(fā)酵液4 000r／min離心15min，過濾，清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，濃縮液加超純水定容至100mL，待測。

將菌體用蒸餾水反復(fù)洗滌，于－50 ℃真空冷凍干燥獲得凍干菌體，放入干燥器維持恒重。精確稱取0.500g凍干菌溶于10mL 超純水中，利用超聲波提取Cordycepin。提取后10 000r／min離心15min，過濾，取上清液，反復(fù)提取2 次，定容至25mL。超聲條件：100 W，60 ℃，40min。

將發(fā)酵液及凍干菌提取液適當(dāng)稀釋，利用紫外分光光度計(jì)測定Cordycepin的含量。

1.2.5 生物量測定

將發(fā)酵液4 000r／min離心15min，過濾，蒸餾水反復(fù)洗滌，于－50 ℃真空冷凍干燥后，凍干菌體放入干燥器保持恒重，用分析天平稱量。

生物量／（g·L－1）＝菌絲體干重／發(fā)酵液體積

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變菌最佳稀釋度的確定

將單孢子懸液取稀釋度分別為10－1，10－2，10－3，10－4，檢驗(yàn)誘變因子超聲波和DES 分別對出發(fā)菌株C.militarisFFCC5111的影響。如表1所示，當(dāng)稀釋度為10－3時(shí)，致死率分別為88.17%和85.47%。通常當(dāng)微生物致死率在75%～90%時(shí)，發(fā)生正向突變的概率最高，因此確定10－3為最佳誘變稀釋倍數(shù)。

表1 誘變因子超聲波和DES對菌液稀釋倍數(shù)的影響Tab.1 Effect of mutagenic factors ultrasound and diethyl sulfate on the germ liquid dilution ratio

2.2 最佳誘變時(shí)間的確定

按照“1.2.2”所述的超聲波誘變、DES 誘變和復(fù)合誘變3種方法，檢測處理時(shí)間從0～60min對出發(fā)菌株致死率的影響。稀釋度均取10－3。結(jié)果如圖1所示。由圖1 可知，3 種誘變方案的致死率隨作用時(shí)間延長而增大，且復(fù)合誘變強(qiáng)度要高于單因子誘變強(qiáng)度。當(dāng)誘變時(shí)間達(dá)到60min時(shí)，誘變因子超聲波和DES 作用于單孢子懸液的致死率分別為77.17%和89.76%。而當(dāng)復(fù)合誘變35 和45 min 時(shí)，致死率分別為83.33%和88.56%，均比較適合篩選；當(dāng)60 min時(shí)，致死率達(dá)到95%。但無論從誘變強(qiáng)度還是誘變效果看，采用超聲波聯(lián)合DES復(fù)合誘變均優(yōu)于單因子誘變。最終選用的最佳復(fù)合誘變條件為：1%DES，200 W、22kHz超聲強(qiáng)度，處理45min。

圖1 不同誘變時(shí)間的菌株致死率Fig.1 Strain death rate under different treatment time

2.3 營養(yǎng)缺陷型的篩選

根據(jù)“1.2.3.3”所述方法，將獲得的Xan－＋Gua－雙重營養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)／發(fā)酵6d，將菌體冷凍干燥后制備Cordycepin，在指示菌B.subtilis平板上進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。如圖2所示，根據(jù)“1.2.3”方法篩選鑒定出雙營養(yǎng)缺陷型（Xan－＋Gua－）共7株，檢測搖瓶培養(yǎng)／發(fā)酵至16d時(shí)溶液中Cordycepin 的產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

圖2 雙營養(yǎng)缺陷型（Xan－＋Gua－）抗菌活性Fig.2 Antibacterial activity of double auxotroph mutant（Xan－＋Gua－）strain

由圖2 和表2 可見，發(fā)酵16d 時(shí)發(fā)酵液中Cordycepin產(chǎn)量與在B.subtilis平板上抑菌圈直徑結(jié)果一致。誘變菌株C.militarisFFCC5111－c的抑菌圈最大，同時(shí)生產(chǎn)的Cordycepin 能力較C.militarisFFCC5111提高了約40.2%。

表2 雙營養(yǎng)缺陷型（Xan－＋Gua－）突變株和原始菌株Cordycepin產(chǎn)量Tab.2 Cordycepin production of double auxotroph mutant（Xan－＋Gua－）and original strain

2.4 搖瓶培養(yǎng)／發(fā)酵過程中生物量和Cordycepin的變化

蟲草菌在培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，生物量將會增長達(dá)到幾乎恒量，在0～20g／L 葡萄糖含量線性降低，雙營養(yǎng)缺陷型（Xan－＋Gua－）突變株C.militarisFFCC5111－c合成Cordycepin 的能力明顯提高，見圖3、圖4。

由圖3可知，發(fā)酵第6 天，C.militarisFFCC5111菌已進(jìn)入對數(shù)生長期，至第10天生物量達(dá)到最高為21.2g／L，然后略有下降，隨后基本上維持穩(wěn)定；而C.militarisFFCC5111－c細(xì)胞生長速度略慢于親株，但其葡萄糖消耗速率大于親株。比較圖4，可能的原因是C.militarisFFCC5111－c的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，合成Cordycepin能力有了明顯提升。

原始菌株C.militarisFFCC5111培養(yǎng)／發(fā)酵至第16 天，發(fā)酵液中Cordycepin 積累量達(dá)到2.85g／L；菌體內(nèi)的積累量則在第10天達(dá)到峰值3.124 mg／g。雙突變株C.militarisFFCC5111－c的發(fā)酵液中Cordycepin不斷積累，第16 天達(dá)到最大3.995g／L；其在菌體內(nèi)的積累量6～13d幾乎線性增長，第13天達(dá)到峰值7.924mg／g，隨后略有下降。最高值突變株比出發(fā)株分別提高了1.41和2.54倍（圖4）。

圖3 C.militaris FFCC5111－c和C.militaris FFCC5111發(fā)酵過程生物量與葡萄糖消耗變化Fig.3 Biomass and glucose consumption of C.militaris FFCC5111－c and C.militaris FFCC5111in fermentation process

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液和菌絲體Cordycepin的積累變化Fig.4 Cordyceps accumulation of Cordyceps militaris fermentation broth and mycelium at different fermentation time

3 討論與結(jié)論

本研究利用一株生長性狀優(yōu)良的Cordyceps militarisFFCC5111為出發(fā)菌株，采用超聲波聯(lián)合DES復(fù)合誘變技術(shù)，通過抗菌實(shí)驗(yàn)初篩、搖瓶培養(yǎng)／發(fā)酵復(fù)篩，針對性的篩選出雙重營養(yǎng)缺陷型菌株（Xan－＋Gua－）C.militarisFFCC5111－c。突變株經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)／發(fā)酵至第16 天，C.militarisFFCC5111－c培養(yǎng)／發(fā)酵產(chǎn)生的Cordycepin總量為4.142g／L，比親株提高了44.5%。試驗(yàn)證明，篩選Xanthine和Guanine雙重缺陷型突變株是獲得Cordycepin高產(chǎn)菌種行之有效的方法之一，同時(shí)也驗(yàn)證了Cordycepin的生產(chǎn)與鳥嘌呤是彼此相關(guān)的［13］。

Cordycepin提取的方法目前有許多報(bào)道，有柱層析法（CCE）［14］、微波法和超聲法提取蟲草素［15］。但超聲提取方法更快捷簡便且準(zhǔn)確度高，因此采用超聲法提取蟲草素。本試驗(yàn)采用－40～－50 ℃冷凍干燥法（菌體部分）和減壓濃縮法（液體部分）。超聲波是頻率高于20kHz的聲波，穿透能力強(qiáng)，方向性好，可以改變細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生物質(zhì)交換。硫酸二乙酯（DES）是一種誘變譜較為廣泛的烷化劑，能與DNA 中堿基的磷酸部分發(fā)生烷化作用，從而引起DNA 復(fù)制時(shí)堿基配對的轉(zhuǎn)換或顛換。復(fù)合誘變因子的使用，可以提高誘變的效率。據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判斷，嘌呤核苷酸的代謝途徑中IMP→XMP→GMP的代謝支路可能被切斷，使代謝前體物質(zhì)IMP較多地合成腺苷，進(jìn)一步合成Cordycepin［16］。

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