李瑞東，李瑞玉，高靜炎

(邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院，河北 邢臺 054000)

論 著

化濁抑潰安腸湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

李瑞東，李瑞玉，高靜炎

(邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河北 邢臺 054000)

目的探討化濁抑潰安腸湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。方法將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組、化濁抑潰安腸湯組,每組15只。除正常組外,其余各組均采用5%2,4,6三硝基苯磺酸灌腸復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型,造模后，模型組、柳氮磺吡啶組、化濁抑潰安腸湯組分別給予生理鹽水、柳氮磺吡啶混懸液、化濁抑潰安腸湯灌胃，1次/d，連續(xù)4周。4周后處死大鼠，鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞凋亡情況，用免疫組織化學(xué)染色及TUNEL染色觀察大鼠結(jié)腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果模型組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯高于正常組，Bax蛋白表達(dá)量明顯低于正常組；柳氮磺吡啶組、化濁抑潰安腸湯組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯低于模型組，Bax蛋白表達(dá)量明顯高于模型組，且化濁抑潰安腸湯組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯低于柳氮磺吡啶組，Bax蛋白表達(dá)量明顯高于柳氮磺吡啶組。結(jié)論化濁抑潰安腸湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞凋亡有一定的調(diào)節(jié)作用，可上調(diào)大鼠Bcl-2水平，下調(diào)Bax水平。

化濁抑潰安腸湯；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種原因尚不明確的結(jié)腸黏膜慢性炎癥和潰瘍病變，主要累及直腸和乙狀結(jié)腸，嚴(yán)重時(shí)可累及全結(jié)腸，其病理表現(xiàn)主要為黏膜和黏膜下層的慢性炎性細(xì)胞浸潤、隱窩膿腫、黏膜潰瘍以及腺體和上皮的損傷。西醫(yī)采用免疫抑制劑、水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素治療短期效果較好，但易復(fù)發(fā)，遷延難愈[1]。目前研究表明，結(jié)腸黏膜淋巴細(xì)胞增殖與凋亡以及它們之間的相對平衡關(guān)系影響著潰瘍性結(jié)腸炎的修復(fù)過程[2]，細(xì)胞是否凋亡決定著潰瘍的愈合情況[3]。Bcl-2和Bax蛋白主要分布于細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體上[4]，在決定細(xì)胞增殖與凋亡過程中起決定作用，其中Bcl-2蛋白拮抗細(xì)胞凋亡，而Bax蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩者比值決定細(xì)胞增殖還是凋亡。化濁抑潰安腸湯是從"濁毒"的致病理論出發(fā)研制而成的具有解毒化濁、健脾祛濕安腸作用的中藥復(fù)方，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著，復(fù)發(fā)率低，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究選擇三硝基苯磺酸免疫造模法復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型(該模型的制備與人類結(jié)腸潰瘍在組織形態(tài)上頗為相似，是目前普遍認(rèn)可的使用方法)，觀察了化濁抑潰安腸湯對模型大鼠Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，旨在探討該復(fù)方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級健康SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(240±20)g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：DK1209041，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2試劑 5% 2,4,6,三硝基苯磺酸(TNBS)購自上海信裕生物科技有限公司；無水乙醇和戊巴比妥鈉購自上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：20120287。TUNEL染色試劑盒由北京博爾邁生物技術(shù)有限公司提供；大鼠Bcl-2及Bax免疫組化試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3藥物 化濁抑潰安腸湯由我院中藥房提供，藥物組成：白頭翁60 g、黃連15 g、人參10 g、黃芪30 g、秦皮12 g、苦參12 g、地榆15 g、廣木香12 g、薏苡仁30 g、當(dāng)歸15 g、白芍15 g、茯苓15 g、白術(shù)12 g、甘草9 g。按處方稱取藥材，加入清水煎煮，水浴濃縮到所需濃度備用。柳氮磺吡啶腸溶片(SASP)，0.5 g/片，上海福達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，批號：044131005。

1.4方法

1.4.1造模、分組及給藥 健康清潔級SD大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組、化濁抑潰安腸湯組，每組15只。正常組不造模、不灌胃，正常喂養(yǎng)；其余各組大鼠禁食24 h后稱體質(zhì)量，使用1%戊巴比妥鈉30 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，以直徑為2 mm的橡膠管插入大鼠結(jié)腸8 cm處，向結(jié)腸腔內(nèi)灌注TNBS液60 mg/kg[5]，將大鼠倒立30 s，使藥液到達(dá)全結(jié)腸，然后放回籠待其自然蘇醒。模型組于造模后第2天給予10 mL/kg生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周；柳氮磺胺吡啶組于造模后第2天給予柳氮磺吡啶灌胃，先將藥片研成粉狀，過篩后用蒸餾水配成混懸液，按0.267 g/kg(相當(dāng)于成人用藥量的8倍)給藥，每日1次，連續(xù)4周；化濁抑潰安腸湯組于造模后第2天給予化濁抑潰安腸湯灌胃，將中藥水煎后濃縮成4.59 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.4.2TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡情況 以上4組除正常組外，分別選取潰瘍病變最明顯的腸段，各取3塊組織進(jìn)行活檢，所取標(biāo)本在10%福爾馬林溶液中浸泡5 min固定，HE染色。所有標(biāo)本在放大400倍的鏡下觀察，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)中凋亡細(xì)胞比率的均數(shù)為凋亡指數(shù)。在同一條件的光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色；凋亡細(xì)胞核中有棕黃色或棕褐色顆粒表達(dá)，細(xì)胞核染色深淺不一。

1.4.3結(jié)腸組織中Bax和Bcl-2表達(dá)檢測 采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測。將石蠟切片切成5 μm厚，先用二甲苯脫蠟處理，再用梯度乙醇水化；枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)在高溫、高壓下使抗原修復(fù)2 min，每張切片均加用動(dòng)物免疫血清室溫下孵育10 min，去掉血清，加用Bcl-2和Bax抗體，4 ℃?zhèn)溆茫?PBS液洗5 min×3次，再加用生物標(biāo)記第二抗體，室溫下孵育10 min，PBS液洗5 min×3次，蘇木素復(fù)染，用已知陽性標(biāo)本作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽性細(xì)胞的百分比，并在放大100倍鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。在光鏡下胞質(zhì)呈棕黃色或褐色顆粒為陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1TUNEL染色細(xì)胞凋亡情況 病理切片HE染色，正常組鏡下腸黏膜上皮完整，各層結(jié)構(gòu)清晰，腺體結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，黏膜下血管豐富，無充血水腫，無潰瘍糜爛，杯狀細(xì)胞豐富，固有層可見毛細(xì)血管和散在的淋巴細(xì)胞，見圖1；模型組鏡下黏膜層完全脫失，黏膜下有大量炎細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞明顯減少，可見因壞死而無結(jié)構(gòu)的嗜伊紅組織，潰瘍及不同程度的灶性糜爛形成，少量炎性肉芽組織增生，腸腔可見滲出液及壞死組織，黏膜肌消失，見圖2；柳氮磺胺吡啶組黏膜下間質(zhì)水腫，較多致密的膠原纖維與潰瘍面平行排列，固有層及黏膜下層炎細(xì)胞浸潤，潰瘍周邊腸黏膜腺體杯狀細(xì)胞減少，部分黏膜仍可見到滲出、壞死，見圖3；化濁抑潰安腸湯組腺體排列較規(guī)整，可見大量的杯狀細(xì)胞，黏膜下間質(zhì)輕度水腫，間質(zhì)少量炎細(xì)胞浸潤，見圖4。

圖1 正常組 HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 模型組HE染色表現(xiàn)(×400)

圖3 柳氮磺胺吡啶組HE染色表現(xiàn)(×400)

圖4 化濁抑潰安腸湯組HE染色表現(xiàn)(×400)

2.2大鼠結(jié)腸黏膜組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況 正常大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞可見到少量Bcl-2表達(dá)，主要表達(dá)于結(jié)腸隱窩基底部，見圖5；模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞可見到大量Bcl-2表達(dá)，為固有層炎性細(xì)胞，見圖6；經(jīng)柳氮磺胺吡啶及化濁抑潰安腸湯治療后，Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)不同程度減弱，見圖7及圖8。Bax在正常大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，見圖9；模型組病變部位表達(dá)較弱，見圖10；經(jīng)柳氮磺胺吡啶及化濁抑潰安腸湯治療后， Bax不同程度增強(qiáng)，見圖11及圖12。各組大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞組織中Bcl-2 、Bax表達(dá)量見表1。模型組大鼠結(jié)腸黏膜中，上皮細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均有Bcl-2陽性表達(dá)，其中淋巴細(xì)胞表達(dá)率最高，上皮細(xì)胞表達(dá)率最低，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2；Bax在漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的表達(dá)率明顯低于正常組(P均<0.05)，在上皮細(xì)胞中的表達(dá)率2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎屬中醫(yī)“休息痢”“瀉下”等范疇，導(dǎo)師李佃貴教授在長期臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上總結(jié)認(rèn)為該病可從“濁毒”致病角度論治，所擬化濁抑潰安腸湯用于治療該病效果較好。方中重用白頭翁為君藥，該藥入大腸經(jīng)，能清熱燥濕、止血止痢，黃連清熱燥濕，與白頭翁一起祛除大腸濕熱[6]，切中潰瘍性結(jié)腸炎濕熱壅滯大腸、留戀不去之病機(jī)。以人參、黃芪、茯苓、白術(shù)為臣，鼓舞正氣，健脾益氣，以助生化之源：黃芪溫養(yǎng)脾胃而生肌，補(bǔ)益氣血而托毒，與人參配伍，能使氣血不足、久潰不斂者生肌收口，此組藥物針對潰瘍性結(jié)腸炎正虛之本證所設(shè)。佐以薏米、苦參、秦皮健脾燥濕，解毒止??；木香、地榆、當(dāng)歸活血化瘀、補(bǔ)血止血、行氣止痛，專為調(diào)理患者久病入血、氣滯血凝、氣虛血少、血不歸經(jīng)癥狀所設(shè)。白芍和甘草調(diào)和諸藥，緩急止痛。諸藥合用，調(diào)和氣血腸胃、清利濕熱，既解毒化濁、清熱利濕，又健脾溫腎，更兼澀腸止瀉、活血化瘀。如此運(yùn)用則能使正虛補(bǔ)，邪實(shí)祛，很大程度上緩解了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)作[6]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，方中黃連含小檗堿(黃連素)、甲級黃連堿等多種生物堿，對多種革蘭陽性和陰性菌有抑制作用，對痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等有較顯著抑制作用，以黃連粉法直接噴到潰瘍部位或定位灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎均取得較好療效[7]；木香含有揮發(fā)油和總生物堿，對胃腸道有興奮和抑制的雙向作用[7]；人參、黃芪、當(dāng)歸、黃連能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，人參皂甙和人參多糖是人參調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分；黃芪、當(dāng)歸、黃連、地榆還有不同程度的抗炎抑菌作用。

圖5 正常組 Bcl-2表達(dá)情況(×200)

圖6 模型組Bcl-2表達(dá)情況(×200)

圖7 柳氮磺胺吡啶組Bcl-2表達(dá)情況(×200)

圖8 化濁抑潰安腸湯組Bcl-2表達(dá)情況(×200)

圖9 正常組Bax表達(dá)情況(×200)

圖10 模型組Bax表達(dá)情況(×200)

圖11 柳氮磺胺吡啶組Bax表達(dá)情況(×200)

圖12 化濁抑潰安腸湯組Bax表達(dá)情況(×200)

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞組織中Bcl-2、Bax表達(dá)情況

注:①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2 模型組和正常組結(jié)腸黏膜組織中Bcl-2在各細(xì)胞中的陽性表達(dá)情況 只(%)

注：①與正常組比較，P<0.05。

表3 模型組和正常組結(jié)腸黏膜組織中Bax在各細(xì)胞中的陽性表達(dá)情況 只(%)

注：①與正常組比較，P<0.05。

近年研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎上皮細(xì)胞損傷和黏膜潰瘍與細(xì)胞凋亡有關(guān)[8],細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式，是機(jī)體自身穩(wěn)定的重要凋節(jié)機(jī)制。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中Bcl-2/Bax基因蛋白的調(diào)控起主要作用；在細(xì)胞凋亡的基本調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Bcl-2基因家族起關(guān)鍵作用[9]。Bcl-2抑制caspase激活的細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞存活時(shí)間，增加細(xì)胞對抗多種凋亡的刺激因素。相反，凋亡前分子Bax則通過作用于線粒體，調(diào)節(jié)caspase活性，以二聚體或多聚體形式與Bcl-2結(jié)合，拮抗Bcl-2的作用，可提高細(xì)胞凋亡的敏感性，直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)比例對控制細(xì)胞凋亡的強(qiáng)弱起到關(guān)鍵作用。Bax增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2增強(qiáng)，抑制細(xì)胞凋亡。這說明Bcl-2和Bax基因的重新調(diào)整對腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡、潰瘍愈合起著非常重要的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2廣泛表達(dá)于活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞和固有層炎性細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞中陽性表達(dá)率最高；而大鼠結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞中Bax的表達(dá)較正常組明顯降低，說明潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2表達(dá)增加以炎性細(xì)胞為主，上皮細(xì)胞表達(dá)較弱，而炎性細(xì)胞中Bax表達(dá)減少，提示潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞凋亡的減慢和上皮細(xì)胞凋亡增加同步發(fā)生，上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞凋亡的不協(xié)調(diào)導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的炎性反應(yīng)與上皮的缺失脫落及潰瘍形成，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)異常并誘導(dǎo)結(jié)腸黏膜細(xì)胞凋亡是潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜損傷的分子機(jī)制之一。而化濁抑潰安腸湯能上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，為潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)中藥治療提供了新的理論基礎(chǔ)。但潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚需大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Huazhuo Yikui Anchang decoction on the expression of Bcl-2, Bax gene protein in intestinal mucosa of ulcerative colitis rats

LI Ruidong, LI Ruiyu, GAO Jingyan

(The Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei, China)

Objective It is to explore the mechanism of action of Huazhuo Yikui Anchang decoction (HZYKAC decoction) on ulcerative colitis. Methods 60 SD rats were randomly divided into normal group, model group, willow nitrogen sulfonyl pyridine group, HZYKAC decoction group, each group had 15 rats. All the rats except in normal group were selected to establish ulcerative colitis rats models with 5% 2, 4, 6 trinitrobenzene sulfonic acid by clysis, after establishing model group, willow nitrogen sulfonyl pyridine group, HZYKAC decoction group were respectively given normal saline, willow nitrogen sulfonyl pyridine suspension liquid, HZYKAC decoction by intragastric infusion once per day, and they were treated for 4 weeks. After 4 weeks the rats were killed to observe ulcerative colitis rats colon mucosa laminapropria lymphocyte apoptosis under electron microscope, immunohistochemical staining and TUNEL staining was used to observe the expression of Bcl-2 and Bax protein in colon mucosa lamina propria lymphocyte. Results The expression of Bcl-2 was higher while that of Bax was lower in modal group than that in normal group; the expression of Bcl-2 was lower and that of Bax was higher in willow nitrogen sulfonyl pyridine group, HZYKAC decoction group than that in model group; the expression of Bcl-2 was lower and that of Bax was higher in HZYKAC decoction group than that in willow nitrogen sulfonyl pyridine group. Conclusion HZYKAC decoction has a regulating effect on colon mucosa apoptosis in ulcerative colitis rats, which can up-regulating Bcl-2 and down-regulating Bax.

Huazhuo Yikui Anchang decoction; Bcl-2; Bax; rat; ulcerative colitis

李瑞東，女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療消化系統(tǒng)疾病的研究。

李瑞玉，E-mail:liruiyu651021@163.com

河北省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(122777105)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.31.001

R-332

A

1008-8849(2015)31-3421-05

2015-06-01