朱 雄，張 琳，侯學(xué)霞，耿 震，陳 海，陳 婷，俞書義，郝 琴

海南省關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者萊姆病調(diào)查

朱 雄1，張 琳2，侯學(xué)霞2，耿 震2，陳 海1，陳 婷1，俞書義1，郝 琴2

目的 了解我國海南省關(guān)節(jié)炎或神經(jīng)性疾病患者的萊姆病感染狀況，并確認(rèn)海南省是否存在萊姆病人。方法 海南省三亞市人民醫(yī)院提供血清542份，均為關(guān)節(jié)炎或神經(jīng)性疾病患者。采用間接免疫熒光法(Indirect Fluorescent-Antibody Test, IFA)和免疫印跡法(Western Blot，WB)對血清標(biāo)本進(jìn)行萊姆病抗體檢測；并采用巢式PCR法對WB抗體陽性的血清標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測。結(jié)果 IFA方法檢測血清樣本542份，54份陽性，陽性率為9.96%。應(yīng)用WB法對上述54份IFA陽性血清樣本進(jìn)行檢測，12份陽性。采用巢式PCR方法檢測12份WB陽性樣本，2份陽性，測序結(jié)果表明兩份均為B.garinii基因型。結(jié)論 本研究證實(shí)了海南省人群中存在萊姆病。建議當(dāng)?shù)蒯t(yī)生在診治關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)性疾病患者時(shí)，可以考慮其是否罹患萊姆病。

萊姆?。谎鍢?biāo)本；抗體檢測；病原學(xué)檢測

萊姆病是一種由蜱傳播的人獸共患病，其致病病原體為伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)，俗稱萊姆病螺旋體，可引起人體多系統(tǒng)、多器官的損害。自1982年Burgdorfer及其同事分離到萊姆病病原體以來[1]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)全世界五大洲70多個(gè)國家有萊姆病的存在，且發(fā)病區(qū)域和發(fā)病率均呈擴(kuò)大和上升趨勢[2]。

我國自上世紀(jì)80年代開始研究萊姆病以來，已在29個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)開展了萊姆病人群血清流行病學(xué)調(diào)查，并從20個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)的病人、動物和/或蜱中分離出病原體，證實(shí)我國存在萊姆病的自然疫源地，部分地區(qū)還有典型萊姆病病例存在[3-4]。萊姆病作為地方性傳染病，在我國的分布也呈現(xiàn)區(qū)域性聚集的態(tài)勢，主要集中在東北、內(nèi)蒙古和新疆等地。萊姆病的發(fā)生依賴于其媒介以及宿主動物的分布[4-5]。我國南方一些地區(qū)也有萊姆病的發(fā)生，然而較之北方地區(qū)，了解相對較少。海南省位于我國南海，與中國大陸隔海相望，尚未有關(guān)于萊姆病的研究報(bào)道。因此，我們開展對海南省人群萊姆病的調(diào)查是有必要的。

根據(jù)美國CDC的建議，我們采用兩步法對病人血清進(jìn)行萊姆病抗體檢測，即：IFA或ELISA作為初篩試驗(yàn)，WB作為確診試驗(yàn)。根據(jù)不同的基因型，美國和歐洲分別制定了其WB檢測陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。我國也針對B.g.和B.a.兩種優(yōu)勢基因型，制定了WB的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。

1 材料方法

1.1 血清樣本的收集 2013年3月6日至8月21日，我們從三亞人民醫(yī)院收集了542份血清。所有血清均來源于患有關(guān)節(jié)炎癥狀或神經(jīng)癥狀，均排除風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他疾病。病人的年齡跨度從3～89歲，男性比例占到病人總數(shù)的50.18%。

1.2 主要試劑 羊抗人IgM和IgG 熒光抗體、HRP標(biāo)記的羊抗人IgM和SPA，均購自美國Sigma公司。DNA 提取試劑盒(DNeasy?Blood & Tissue Kit)由德國QIAGEN 公司提供。引物由天一輝遠(yuǎn)生物公司合成。PCR相關(guān)試劑由天根生物公司提供。萊姆病抗原片和WB膜條由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所萊姆病室提供。

1.3 DNA的提取

1.3.1 陽性對照DNA的提取 將我實(shí)驗(yàn)室保存的PD91菌株于BSK培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度達(dá)到107bacteria/mL時(shí)，將全部培養(yǎng)基裝至1.5 mL Eppendorf離心管中，13 200 r/min離心30 min，棄去上清液，然后用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌3遍，棄去上清液，然后加入100 μL ddH2O重懸，恒溫金屬浴上100 ℃水煮10 min，最后3 500 r/min離心5 min，吸取上清液保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.3.2 血清樣本DNA的提取 采用DNeasy?Blood & Tissue Kit(DNA 提取試劑盒)，提取542份血清樣本DNA。具體操作按說明書進(jìn)行。

1.4 萊姆病抗體檢測

1.4.1 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA) 將血清用3%卵黃液從1∶16開始倍比稀釋，在熒光顯微鏡40×10視野下，50%以上螺旋體染上明亮熒光，抗體效價(jià)IgM≥1∶64，IgG≥1∶128為陽性。同時(shí)做陽性、陰性對照。

1.4.2 蛋白免疫印跡法 (WB) 將IFA初篩的陽性標(biāo)本，進(jìn)一步用WB檢測。用PBS-T以1∶25稀釋血清并浸泡抗原條，震蕩4 h，洗脫5次，每次至少10 min，將抗原條分別加入二抗IgG或IgM，過夜。再經(jīng)過洗脫5次，每次至少10 min，加入顯色劑顯色30 min。顯色結(jié)束，用純水終止反應(yīng)。WB結(jié)果根據(jù)中國萊姆病WB診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[6-7]。

1.5 Nested PCR

1.5.1 引物 引物參照文獻(xiàn)[8]的rrf(5S)-rrl(23S) rRNA基因間隔區(qū)巢式PCR的引物，引物序列見表1。

1.5.2 巢式PCR反應(yīng)體系及條件 50 μL反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 25 μL，上下游引物(100 μmol/L)各1 μL，第一輪模板4 μL，第二輪模板0.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s(第二輪退火溫度為55 ℃)，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。

1.5.3 巢式PCR產(chǎn)物檢測 巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像拍照。陽性片段約為250 bp左右。

1.5.4 測序及序列分析 將巢式PCR產(chǎn)物送北京擎科生物工程有限公司測序，并在美國NCBI網(wǎng)站上用BLAST對序列進(jìn)行比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 萊姆病血清學(xué)抗體檢測結(jié)果 利用IFA方法檢測血清樣本542份, 54份陽性，其中IgG陽性40份，IgM陽性共16份，有2份樣本的IgG和IgM同時(shí)為陽性(見表2)。這次調(diào)查結(jié)果顯示，海南省關(guān)節(jié)炎或神經(jīng)性疾病患者的萊姆病的IFA陽性率為9.96%。54例陽性標(biāo)本的患者年齡跨度為15～93歲。其中10～39歲有13人，40～69歲有20人，70～99歲有11人，另有10份樣本無年齡報(bào)告。全部54份陽性包括25名男性患者，29名女性患者。

對IFA檢測陽性的54份血清樣本進(jìn)一步用WB方法確認(rèn)，結(jié)果顯示共有12份WB檢測陽性，其中IgG陽性7份，IgM陽性5份。具體結(jié)果見表3。

2.2 Nested PCR檢測結(jié)果 我們利用巢式PCR方法對12份WB檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示有2例病人血清呈陽性。測序結(jié)果與美國NCBI網(wǎng)站上的參考序列比對發(fā)現(xiàn)兩例陽性病人標(biāo)本所擴(kuò)增出的基因片段均與B.garinii.基因型高度相似。2例病人中1例為83歲女性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者(No.750)，其WB IgM陽性,為近期感染的患者；另1例為56歲男性關(guān)節(jié)炎患者(No.392)，其WB IgG陽性,為感染4～6周以上的患者。

3 討 論

萊姆病分布廣泛，全球已有70多個(gè)國家報(bào)告發(fā)現(xiàn)該病，且發(fā)病率呈上升趨勢，新的疫源地不斷發(fā)現(xiàn)。萊姆病的傳播主要依賴于媒介蜱及其宿主動物。這種自然疫源性疾病根據(jù)不同的地理環(huán)境，在自然界的循環(huán)也不同[9]。國內(nèi)許多研究表明，我國29個(gè)省(市、自治區(qū))在不同程度上都有人感染萊姆病的報(bào)道，感染率較高的地區(qū)主要集中在東北林區(qū)、內(nèi)蒙古地區(qū)、新疆中部以及甘肅等地。南方一些地區(qū)比如云貴高原、湖北、福建等地也有萊姆病病例的報(bào)道[3-4,10-11]。海南省位于我國南海，它的自然地理?xiàng)l件與我國萊姆病發(fā)生率高的地區(qū)差異極大，尚未有過報(bào)道。 2011年的一項(xiàng)調(diào)查研究證明海南省存在蜱傳疾病[12]，因此對海南省進(jìn)行萊姆病調(diào)查是有必要的。

本次研究首次從海南省當(dāng)?shù)厝巳貉逯袡z出萊姆病的感染，表明海南省人群中存在萊姆病的感染，在關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)性疾病患者中其萊姆病感染率達(dá)9.96%，并且通過WB方法，確診萊姆病12例。表明在海南省存在臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的萊姆病患者。提示當(dāng)?shù)氐呐R床醫(yī)生在遇到相關(guān)癥狀的病人時(shí)應(yīng)考慮萊姆病的鑒別診斷。

利用rrf-rrl基因間隔區(qū)nested PCR方法，對血清學(xué)確診的12例陽性病例進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)2例檢測結(jié)果呈陽性。序列分析表明此2例患者為B.garinii基因型菌株感染，提示海南省存在B.garinii基因型致病性菌株. 海南省位于我國南海，其地理氣候與臺灣島以及廣東、福建等沿海省份相近。臺灣為萊姆病的自然疫源地，存在多種基因型的萊姆病螺旋體，其主要傳播媒介為粒形硬蜱，主要宿主動物為黃毛鼠和褐家鼠[13-14]。廣東和福建也早在90年代就被證實(shí)存在萊姆病的自然疫源地，福建從粒形硬蜱和社鼠、褐家鼠體內(nèi)分離到萊姆病螺旋體[11]，廣東省從白腹巨鼠和針毛鼠分離到萊姆病螺旋體[15-16]。

今后應(yīng)進(jìn)一步對海南省的媒介、宿主等進(jìn)行調(diào)查，從而明確海南省萊姆病的主要媒介和宿主動物，以及主要病原類型，從而為海南省萊姆病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

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Investigation on Lyme Disease of patients with arthritis or neurological disorders in Hainan Province, China

ZHU Xiong1,ZHANG Lin2,HOU Xue-xia2,GENG Zhen2,CHEN Hai1,CHEN Ting1,YU Shu-yi1,HAO Qin2

(1.Clinical Laboratory, Sanya Peoples' Hospital, Hainan Province, Sanya 572000, China; 2.State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

To investigate the infection status of Lyme spirochete in patients with arthritis or neurological disease in Hainan Province of China, and to confirm the presence of Lyme disease in Hainan Province, a total of 542 serum samples with arthritis or nervous system disease suspected withB.burgdorferiinfection were collected from Sanya Peoples' Hospital, Hainan Province. Antibodies for Lyme disease in serum samples were detected by Indirect Fluorescent-Antibody Test (IFA) and Western blot (WB); and the nested PCR method was used to test the pathogen in the WB positive serum samples. Results showed that 54 in total of 542 serum samples were tested positive by IFA, the positive rate was 9.96%. In the 54 IFA-positives, 12 were confirmed positive by WB. Two in 12 WB confirmed positives were tested positive by nested PCR. Sequence analysis showed the two samples were infected byB.gariniistrains. This research confirmed the existence of human Lyme disease in Hainan Province. We suggested that Lyme disease should be commonly considered by clinicians when the patients had some related symptoms of Lyme disease in Hainan, China.

Lyme disease; serum samples; antibody test; etiological test

Hao Qin, Email: haoqin@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.013

國家“十二五”傳染病重大專項(xiàng)(2012ZX10004219 和2013ZX10004-101)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(814389)；三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(YW1244)(朱雄和張琳同等貢獻(xiàn))

郝琴，Email: haoqin@icdc.cn

1.海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，三亞 572000; 2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206

R514

A

1002-2694(2015)04-0353-04

2014-11-02；

2015-01-05

Supported by the Major Project of the Twelfth Five Year Special for infectious diseases (Nos. 2012ZX10004219 and 2013ZX10004-101), the Natural Science Foundation of Hainan Province (No. 814389), and the Innovation Projects of Science and Technology in Medical and Health Area, Sanya (No. YW1244)

Zhu Xiong and Zhang Lin contribute equally to this study.