張志勤，項國仕(綜述)， 黃孝天(審校)

腸道病毒71型VP1蛋白研究進(jìn)展

張志勤，項國仕(綜述)， 黃孝天(審校)

腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)為手足口病的主要病原體。目前，手足口病的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，臨床上缺乏有效的疫苗及特異性治療藥物。作為EV71主要衣殼蛋白，VP1在EV71的吸附和穿入過程中起著重要作用。另一方面，VP1上存在特異性中和性抗原表位，在EV71疫苗研究中占有重要地位。本文主要概括EV71 VP1結(jié)構(gòu)、功能及與之相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展。

手足口病;腸道病毒71型;衣殼蛋白

據(jù)2013年國際病毒分類委員會最新分類，EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A種腸道病毒。病毒顆粒呈球形, 無包膜, 衣殼為二十面體立體對稱, 由60個相同的亞單位構(gòu)成, 每個亞單位均包含VP1、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。EV71為手足口病的主要病原體之一，由EV71引起的手足口病大部分是輕微及自限性的，但仍有部分患者的病情進(jìn)展為重癥神經(jīng)系統(tǒng)疾病及致命性腦炎。Yu[1]等通過2008-2012年中國手足口病流行病學(xué)調(diào)查顯示，80%以上的重癥病例以及90%以上的死亡病例由EV71感染所致。VP1作為EV71的結(jié)構(gòu)蛋白，且EV71主要的中和抗原決定簇集中于VP1上，因此具有重要的研究意義。

1 EV71 VP1結(jié)構(gòu)

EV71 VP1蛋白包含297個氨基酸(amino acid, aa)，大小為32 kD。晶體結(jié)構(gòu)顯示，VP1具有 “果凍卷”型的β-桶狀結(jié)構(gòu)，這種桶狀結(jié)構(gòu)包括8個β-折疊，分別排列于2個β-片層中，每個片層包含4個β折疊，其中1、8、3、6 β-折疊 形成一個β片層，而2、7、4、5 β-折疊形成另外一個β片層。VP1中還包括另一個重要的結(jié)構(gòu)：疏水性口袋因子。此結(jié)構(gòu)在EV71和其他腸道病毒中存在不同，在EV71中，口袋因子有約40 ?2的表面積，主要暴露在VP1五聚體周圍的峽區(qū)的表面，并經(jīng)VP1 β桶狀結(jié)構(gòu)直達(dá)深處，其中包含天然脂質(zhì)成分[2-3]，而在其他腸道病毒中，口袋因子是被完全包埋的。病毒表面，VP1 β桶狀結(jié)構(gòu)區(qū)存在一個深凹，此凹陷被認(rèn)為是EV71病毒的粘附位點，也被稱為峽谷樣結(jié)構(gòu)(canyon)[4]。EV71衣殼內(nèi)表面結(jié)構(gòu)與其他腸道病毒也存在差異，這種差異通常表現(xiàn)在VP1上，腸道病毒中VP1第1-28 aa通常朝向五重旋轉(zhuǎn)對稱軸，而在EV71中轉(zhuǎn)向了另一側(cè)。

小RNA病毒中可變性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)為暴露于病毒表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(loop)，EV71病毒中VP1上存在BC、DE、βE/αB、GF、GH、HI等6個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中BC、DE及HI莖環(huán)結(jié)構(gòu)為扁平并遠(yuǎn)離二十面體的五重旋轉(zhuǎn)對稱軸，BC(96-102 aa)及GH 莖環(huán)結(jié)構(gòu)(208-222 aa)是暴露于最外圍的[3]，此外DE莖環(huán)結(jié)構(gòu)和EF莖環(huán)結(jié)構(gòu)定位于峽谷樣結(jié)構(gòu)表面，由于EV71 VP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)比其他腸道病毒的更小，導(dǎo)致了EV71的峽谷樣結(jié)構(gòu)比其他的腸道病毒更淺[5]。Chen等報道EV71安徽阜陽株與EV71-1095株VP1的GH環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在不同，而SCARB2的結(jié)合域VP1第172位aa(位于峽谷樣結(jié)構(gòu)區(qū))卻沒有觀察到不同[6]，這表明在不同的EV71病毒株間峽谷樣區(qū)域可能保守。

2 EV71 VP1功能

EV71 VP1與其他腸道病毒及其他小RNA病毒結(jié)構(gòu)上的差異均可能導(dǎo)致其功能獨具特性。EV71 VP1作為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其主要功能為協(xié)助病毒感染，結(jié)合細(xì)胞受體。目前，包括多個與EV71相互作用的細(xì)胞受體被鑒定[7-12]，其中與VP1相關(guān)的包括清道夫受體B2(Scavenger receptor class B, member 2,SCARB2)、選擇素P糖蛋白配體1(P-selectin Glycoprotein Ligand,PSGL-1)、人膜聯(lián)蛋白II(human annexin II,Anx2)以及硫酸乙酰肝素類糖胺聚糖(Heparan Sulfate Glycosaminoglycan)。SCARB2是主要表達(dá)于核內(nèi)體及溶酶體膜的III型糖蛋白，EV71與SCARB2的作用是通過結(jié)合到VP1的Gln-172周圍的canyon結(jié)構(gòu)來達(dá)到病毒感染的目的，SCARB2的第4個外顯子與這種相互作用有關(guān)，尤其在酸性條件下，這種作用使完整的病毒體(160S)變成135S的A顆粒，A顆粒被認(rèn)為是完整病毒體與脫殼后病毒的中間物[7]。PSGL-1表達(dá)于骨髓細(xì)胞及受激后的T淋巴細(xì)胞，作為細(xì)胞粘附因子P、E、L高親和性配體，EV71 VP1與白細(xì)胞PSGL-1的相互作用由VP1-145的分子開關(guān)控制，病毒表面賴氨酸與硫酸化PSGL-1的N-末端酪氨酸相互作用，而VP1-145作為一個開關(guān)，通過調(diào)節(jié)VP1-244K的轉(zhuǎn)向來調(diào)控VP1與PSGL-1的結(jié)合，這種作用使EV71更傾向與表達(dá)PSGL-1的白細(xì)胞結(jié)合。同時PSGL-1與白細(xì)胞遷移，細(xì)胞因子產(chǎn)生及免疫反應(yīng)的調(diào)控有關(guān)[8,11]，這可能介導(dǎo)病毒在體內(nèi)的播散，此外過度炎癥因子的產(chǎn)生，將導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的發(fā)生。Anx2是膜聯(lián)蛋白家族的一員。其除通過鈣離子結(jié)合區(qū)域(α螺旋核心區(qū)域)與磷脂膜的相互作用外,還與多種細(xì)胞因子作用參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,如內(nèi)吞及胞吐等過程。在EV71感染過程中，Anx2則是通過與EV71 VP1上第40-100位 aa相互作用來增加病毒感染能力的，這種相互作用在低感染劑量時尤為明顯[10]。Tan[12]等研究表明表達(dá)于細(xì)胞表面的糖胺聚糖中的硫酸乙酰肝素也能作為EV71受體，使用多聚賴氨酸中和細(xì)胞表面陰離子及通過抗硫酸乙酰肝素多肽封閉細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素均能抑制EV71的感染，同時他們還使用三維建模來了解EV71上硫酸乙酰肝素可能的結(jié)合位點。總之，EV71通過不同的受體感染不同細(xì)胞。

除結(jié)合宿主受體外，EV71 VP1還能自身結(jié)合形成二聚體，形成這種二聚體的主要活性區(qū)域位于第66-132位 aa。VP1二聚體的形成導(dǎo)致其三級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，同時使病毒衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)更加簡潔緊湊，這有助于病毒的穿入及釋放[13]。

另外，有研究表明[14]，VP1能激活鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II ,CaMK-II)。CaMK-II存在于許多動物細(xì)胞內(nèi)，尤其在神經(jīng)組織中含量豐富。正常生理狀態(tài)下，CaMK-II在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、骨架蛋白的磷酸化以及學(xué)習(xí)記憶等過程起重要作用。EV71感染后，CaMK-II磷酸化波形蛋白(Vimentin)N端第82位絲氨酸，而波形蛋白的磷酸化及aggresomes的形成是病毒復(fù)制所需要的。具體的作用模式為：被EV71感染的細(xì)胞內(nèi)合成的VP1蛋白介導(dǎo)了CaMK-II Thr286的磷酸化激活CaMK-II，激活的CaMK-II再磷酸化波形蛋白細(xì)絲(filament)Ser82，引起波形蛋白細(xì)絲的分解，VP1結(jié)合被分解的波形蛋白并被轉(zhuǎn)運至核周開始形成病毒復(fù)制中心。復(fù)制中心的形成為病毒基因組的合成提供平臺，這表明VP1在病毒復(fù)制過程中扮演著重要的角色。

此外，VP1還能與乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)相互作用[15]，研究發(fā)現(xiàn)LF能抑制EV71感染，具體作用機(jī)制可能為LF封閉細(xì)胞受體或者直接與病毒顆粒結(jié)合，從而防止病毒結(jié)合受體進(jìn)入細(xì)胞引起感染。盡管LF未被批準(zhǔn)作為治療EV71的藥物，但可將其考慮為抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的一種藥物，輔助治療EV71感染。

EV71 VP1晶體結(jié)構(gòu)及其在基因型間的差異[2-3, 16]均有報道，而一些有關(guān)VP1在EV71病毒生物學(xué)行為中的作用也提出相應(yīng)的模式，如作為RNA釋放的傳感器[3]等，而這些模式的確證都需要我們通過更多的實驗來證實。

3 EV71 VP1相關(guān)疫苗研究

EV71疫苗研究涉及滅活疫苗、減毒活疫苗、DNA疫苗、重組疫苗、多肽疫苗等。而VP1作為主要抗原蛋白則多應(yīng)用于抗原表位疫苗、重組疫苗研究，目前已經(jīng)有許多研究[17-23]在動物水平證實了VP1蛋白及其多肽能有效的預(yù)防EV71感染。

抗原表位疫苗方面，Guang等[22]應(yīng)用覆蓋VP1全長的95條合成多肽免疫小鼠，獲得2個保守的線性化的中和抗原表位SP55 ( 163～177 aa)和SP70 (208～222 aa)，這兩個表位在不同的EV71基因亞型間高度保守，尤其是SP70，幾乎在所有EV71基因亞型間均相同，表明其可作為開發(fā)EV71疫苗的抗原表位。此外，Lim等[23-24]發(fā)現(xiàn)VP1最小抗原決定簇位于215-219 aa及N端12-19 aa。重組疫苗方面，Chen等[18]用轉(zhuǎn)基因鼠(VP1+/+)產(chǎn)的包含VP1蛋白的奶，喂養(yǎng)腹腔注射EV71的幼鼠，發(fā)現(xiàn)外源VP1蛋白能起到保護(hù)幼鼠作用，表明VP1口服疫苗在理論上是有效和可行的。在重組VP1蛋白疫苗研究方面，Cao[17]等用枯草桿菌作為載體將VP1融合其衣殼蛋白COTB蛋白生產(chǎn)表達(dá)VP1蛋白的疫苗，結(jié)果表明重組的疫苗能引起細(xì)胞及體液免疫，這為低成本的疫苗制備提供了線索，同時Chen[25]等利用轉(zhuǎn)基因西紅柿表達(dá)EV71 VP1蛋白作為口服疫苗，實驗證實，在BALB/C小鼠糞便中能檢測到VP1特異性IgA同時血液中也能檢測到VP1特異性IgG，且服用此口服疫苗的小鼠的血清能抑制EV71對橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD cells)的感染，這為轉(zhuǎn)基因西紅柿作為口服疫苗來預(yù)防EV71的可行性提供了實驗及理論基礎(chǔ)。

4 展 望

在EV71感染過程中，VP1蛋白承擔(dān)著重要的角色，參與吸附、穿入、脫殼等過程，實驗研究表明針對VP1設(shè)計的疫苗能保護(hù)實驗動物，能抑制EV71感染或減輕感染后癥狀，這為EV71疫苗開發(fā)提供了實驗及理論基礎(chǔ)。

至今仍未有EV71特效藥及有效的疫苗應(yīng)用于臨床，加速EV71致病機(jī)制的研究及有效疫苗的開發(fā)將成為EV71研究的一項重要內(nèi)容。欣慰的是，中國已研制出的滅活疫苗并對疫苗III期臨床試驗階段的療效、安全性及免疫原性做了詳細(xì)的評估[26-27]，這將為我們抵御這種傳染病提供有力的武器。

[1]Xing W, Liao Q, Viboud C, et al. Hand, foot, and mouth disease in China, 2008-12: an epidemiological study[J]. Lancet Infect Dis, 2014, 14(4): 308-318. DOI: 10.1016/S1473-3099(13)70342-6

[2]Plevka P, Perera R, Cardosa J, et al. Crystal structure of human enterovirus 71[J]. Science, 2012, 336(6086): 1274-1274. DOI: 10.1126/science.1218713

[3]Wang X, Peng W, Ren J, et al. A sensor-adaptor mechanism for enterovirus uncoating from structures of EV71[J]. Nat Struct Mol Biol, 2012, 19(4): 424-429. DOI: 10.1038/nsmb.2255

[4]Ke YY, Chen YC, Lin TH. Structure of the virus capsid protein VP1 of enterovirus 71 predicted by some homology modeling and molecular docking studies[J]. J Computat Chem, 2006, 27(13): 1556-1570. DOI: 10.1002/Jcc.20460

[5]Miyamura K, Nishimura Y, Abo M, et al. Adaptive mutations in the genomes of enterovirus 71 strains following infection of mouse cells expressing human P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. J General Virol, 2011, 92(2): 287-291.

[6]Chen P, Song ZL, Qi YH, et al. Molecular determinants of enterovirus 71 viral entry cleft around gln-172 on vp1 protein interacts with variable region on scavenge receptor b 2[J]. J Biologic Chem, 2012, 287(9): 6406-6420. DOI: 10.1074/jbc.M111.301622

[7]Yamayoshi S, Yamashita Y, Li JF, et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71[J]. Nat Med, 2009, 15(7): 798-801. DOI: 10.1038/nm.1992.Epub 2009 Jun 21.

[8]Nishimura Y, Shimojima M, Tano Y, et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71[J]. Nat Med, 2009, 15(7): 794-797. DOI: 10.1038/nm.1961.Epub 2009 Jun 21.

[9]Yang B, Chuang H, Yang KD. Sialylated glycans as receptor and inhibitor of enterovirus 71 infection to DLD-1 intestinal cells[J]. Virol J, 2009, 6(141): 1-6. DOI: 10.1186/1743-422x-6-141

[10]Yang SL, Chou YT, Wu CN, et al. Annexin II binds to capsid protein VP1 of enterovirus 71 and enhances viral infectivity[J]. J Virol, 2011, 85(22): 11809-11820. DOI: 10.1128/JVI.00297-11

[11]Nishimura Y, Lee H, Hafenstein S, et al. Enterovirus 71 binding to PSGL-1 on leukocytes: VP1-145 acts as a molecular switch to control receptor interaction[J]. PLoS Pathogens, 2013, 9(7): e1003511-e1003511. DOI: 10.1371/journal.ppat.1003511

[12]Tan CW, Poh CL, Sam IC, et al. Enterovirus 71 uses cell surface heparan sulfate glycosaminoglycan as an attachment receptor[J]. J Virol, 2013, 87(1): 611-620. DOI: 10.1128/JVI.02226-12

[13]Lal SK, Kumar P, Yeo WM, et al. The VP1 protein of human enterovirus 71 self-associates via an interaction domain spanning amino acids 66-297[J]. J Med Virol, 2006, 78(5): 582-590. DOI: 10.1002/Jmv.20579

[14]Haolong C, Du N, Hongchao T, et al. Enterovirus 71 VP1 activates calmodulin-dependent protein kinase II and results in the rearrangement of vimentin in human astrocyte cells[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e73900-e73900. DOI: 10.1371/journal.pone.0073900

[15]Weng TY, Chen LC, Shyu HW, et al. Lactoferrin inhibits enterovirus 71 infection by binding to VP1 protein and host cells[J]. Antiviral Res, 2005, 67(1): 31-37. DOI: 10.1016/j.antiviral.2005.03.005[16]Cifuente JO, Lee H, Yoder JD, et al. Structures of the procapsid and mature virion of Enterovirus 71 strain 1095[J]. J Virol, 2013, 87(13): 7637-7645. DOI: 10.1128/Jvi.03519-12

[17]Cao YG, Li ZH, Yue YY, et al. Construction and evaluation of a novel Bacillus subtilis spores-based enterovirus 71 vaccine[J]. J Appl Biomed, 2013, 11(2): 105-113. DOI: 10.2478/v10136-012-0032-9

[18]Chen HL, Huang JY, Chu TW, et al. Expression of VP1 protein in the milk of transgenic mice: A potential oral vaccine protects against enterovirus 71 infection[J]. Vaccine, 2008, 26(23): 2882-2889. DOI: 10.1016/j.vaccine.2008.03.041

[19]Kiener TK, Premanand B, Kwang J. Immune responses to baculovirus-displayed enterovirus 71 VP1 antigen[J]. Expert Rev Vaccines, 2013, 12(4): 357-364. DOI: 10.1586/Erv.13.18

[20]Meng T, Kolpe AB, Kiener TK, et al. Display of VP1 on the surface of baculovirus and its immunogenicity against heterologous human Enterovirus 71 strains in mice[J]. PLoS One, 2011, 6(7): e21757-e21757. DOI: 10.1371/journal.pone.0021757

[21]Sivasamugham LA, Cardosa MJ, Tan WS, et al. Recombinant Newcastle disease virus capsids displaying enterovirus 71 VP1 fragment induce a strong immune response in rabbits[J]. J Med Virol, 2006, 78(8): 1096-1104. DOI: 10.1002/Jmv.20668

[22]Guang D, Foo W, Alonso S, et al. Identification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides[J]. Virus Res, 2007, 125(1): 61-68. DOI: 10.1016/j.virusres.2006.12.005

[23]Lim XF, Jia Q, Chow VTK, et al. Characterization of a novel monoclonal antibody reactive against the N-terminal region of Enterovirus 71 VP1 capsid protein[J]. J Virologic Methods, 2013, 188(1-2): 76-82. DOI: 10.1016/j.jviromet.2012.11.038

[24]Lim XF, Jia Q, Khong WX, et al. Characterization of an isotype-dependent monoclonal antibody against linear neutralizing epitope effective for prophylaxis of enterovirus 71 infection[J]. PLoS One, 2012, 7(1): e29751.

[25]Chen HF, Chang MH, Chiang BL, et al. Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71[J]. Vaccine, 2006, 24(15): 2944-2951. DOI: 10.1016/j.vaccine.2005.12.047

[26]Zhu F, Xu W, Xia J, et al. Efficacy, safety, and immunogenicity of an enterovirus 71 vaccine in China[J]. N Engl J Med, 2014, 370(9): 818-828.

[27]Li R, Liu L, Mo Z, et al. An inactivated enterovirus 71 vaccine in healthy children[J]. N Engl J Med, 2014, 370(9): 829-837. DOI: 10.1056/NEJMoa1303224

Research progress of enterovirus 71 VP1

ZHANG Zhi-qin,XIANG Guo-shi,HUANG Xiao-tian

(Department of Medical Microbiology, Medical School of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Enterovirus 71 (EV71) is a major causative factor of hand, foot and mouth disease (HFMD). Currently, the mechanism of HFMD is not clearly understood, and neither vaccine nor antiviral therapy is available. As a capsid protein of EV71, VP1 plays an important role during the adsorption and penetration of EV71. The presence of the VP1-specific neutralizing epitopes makes it an important position in the EV71 vaccine research. This review article provides a summary of the structure, function and associated vaccine of EV71 VP1.

hand-foot-mouth disease; enterovirus 71; capsid protein

Huang Xiao-tian, Email:xthuang@ncu.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.018

國家自然科學(xué)基金(No. 81160196)，江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)項目(No.20133BCB23005)

黃孝天，Email: xthuang@ncu.edu.cn

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，南昌 330006

R373.2

A

1002-2694(2015)04-0377-03

2014-08-31；

2015-01-30

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160196) and the Young Scientists Training Program of Jiangxi Province (No. 20133BCB23005)