張建明，王宇平，鄧艷琴，王靈嵐，嚴延生

福建省首例狂犬病街毒分離株基因組序列測定及分析

張建明1，王宇平1，鄧艷琴2，王靈嵐2，嚴延生2

目的 對福建省首次分離的狂犬病毒街毒株進行全基因組序列測定分析，了解病毒序列及進化特征，為進一步研究街毒的遺傳變異規(guī)律積累理論資料。方法 從病毒細胞培養(yǎng)液中直接提取病毒RNA，采取分段RT-PCR的方法進行序列擴增，將獲得的各基因片段進行分子克隆后測序，運用生物學軟件進行拼接得到全基因組序列，并進行分析。結(jié)果 應用自行設計的引物，獲得了狂犬病毒街毒株的全基因組核苷酸序列，編碼區(qū)沒有插入和缺失的發(fā)生，對毒株在N蛋白主要抗原位點發(fā)生的突變?yōu)樵贐細胞表位發(fā)生了379位V→L的突變；糖蛋白抗原位點I(231位)的氨基酸為L；在抗原位點II 199位點發(fā)生了R→G的突變，抗原位點III 333位為精氨酸(R)。與國內(nèi)河北一街毒株BD06無論在G基因的進化上還是N基因的分型上都有著很近的親緣關系。結(jié)論 獲得狂犬病毒株全基因組序列，了解病毒重要的氨基酸位點特征，為進一步探討福建省狂犬病毒變異、傳播機制等奠定基礎。

狂犬病毒；基因組；序列分析

1988年法國巴斯德研究所Tordo等首次完成了狂犬病毒PV株的全基因序列測定[1]。近年來，我國陸續(xù)有不同來源的狂犬病街毒株分離報道[2-5]，不斷有狂犬病毒株的全基因組序列提交到GenBank。比較發(fā)現(xiàn)：各毒株基因組大小不一，各基因的長度也存在一定的差異，不同毒株之間在核甘酸和氨基酸序列上存在一定的變異。我國不同地區(qū)不同宿主動物的街毒株之間存在不同的基因亞型[6]。2008年福建省浦城發(fā)現(xiàn)一只主動攻擊人的可疑狂犬，我們對其腦組織標本進行狂犬病毒街毒株(FJ008)的分離與鑒定[7]。本研究在此基礎上，對分離的狂犬病街毒株進行基因組全序列測定分析，以期了解福建分離株與其他地區(qū)流行株的同源性關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒(QIAGEN公司)；RT-PCR試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Ex Taq DNA 聚合酶及標準分子量DNA(TaKaRa 公司)；質(zhì)粒提取試劑盒購于(TIANGEN公司)。

1.2 病毒分離與鑒定 參考文獻[7]。

1.3 病毒核酸的提取 參照RNA EZ1 Virus Mini Kit v2.0說明書提取培養(yǎng)液的總RNA。提取的核酸用于RT-PCR擴增，或貯存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計與合成 參考GenBank中公開的狂犬病毒全基因組序列信息，進行分析，選定保守區(qū)域，利用生物學軟件設計6對引物進行擴增，見文獻[8]。

1.5 RT-PCR擴增基因片段 以提取的病毒核酸(RNA)為模板，采用一步法RT-PCR進行基因片段擴增，操作參照TaKaRa 公司one step RT-PCR試劑盒說明書進行。

1.6 擴增產(chǎn)物純化、克隆、測序 產(chǎn)物純化參照QIAGEN公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書進行；克隆參照TaKaRa 公司TA克隆試劑盒說明書進行。選取酶切結(jié)果正確的陽性克隆送TaKaRa公司進行測序。

1.7 基因組序列拼接、分析 測序獲得的狂犬病毒基因片段序列在GenBank上進行比對驗證分析后，用分子生物學軟件進行拼接。選擇有代表性的狂犬病毒株序列，根據(jù)各個基因的功能特點，從不同的角度進行多重序列同源性分析，得到不同毒株之間在各個基因上的同源性數(shù)據(jù)，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析。研究中引用到的參考病毒株信息參見表1。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR擴增各分割基因片段 以病毒培養(yǎng)液提取的病毒RNA為模板，運用所設計的6對引物，采用RT-PCR法擴增到了各段相互交疊的基因片段，結(jié)果分別在532 bp、1 533 bp、1 991 bp、2 421 bp、4 108 bp和2 924 bp的位置擴增出了相應的6個片段，與預期大小相符，參見圖1。將擴增的產(chǎn)物通過膠回收、純化后，進行克隆，酶切鑒定結(jié)果均與預期相符。

2.2 全基因組序列拼接、分析 應用生物學軟件對各個基因擴增片段的測序結(jié)果進行拼接處理，除去各分割片段間的重疊區(qū)域，獲得長為11 924 bp的基因組序列。核苷酸序列及編碼氨基酸序列提交至GenBank，登陸號為FJ866835。通過BioEdit軟件分析獲知每個基因編碼區(qū)核苷酸序列保守區(qū)和高變區(qū)的位置，每個基因的核苷酸變異程度都不一致，N和P基因相對保守，G和L基因變異情況相對復雜，各編碼區(qū)的變異類型主要是核苷酸的替換，沒有發(fā)生插入和缺失。

2.3 主要基因編碼氨基酸序列分析

2.3.1 核蛋白氨基酸分析 對已經(jīng)確定的N基因抗原位點、Th細胞表位、B細胞表位和磷酸化位點的變異情況分別進行比較，結(jié)果見圖2-4。從圖中可以發(fā)現(xiàn)：FJ008毒株核蛋白389位磷酸化位點在各個毒株中均未發(fā)生變異，在不同毒株的抗原位點和淋巴細胞表位的部位均發(fā)現(xiàn)有氨基酸的變異存在，這幾個抗原位點氨基酸的變異情況顯示，F(xiàn)J008與街毒或者分離街毒的減毒株(CTN、CVS、BD06和SADB19等)之間具有相似的變異情況，而與疫苗株(RC-HL和3aG等)之間都有不同程度氨基酸的改變。FJ008毒株核蛋白Th細胞表位沒有變異發(fā)生。FJ008毒株核蛋白主要抗原在379位點(也屬于B細胞表位)由V變成L。

M: DL20000; 1-6: PCR product A (532 bp); B (1 533 bp); C(1 991 bp); D (2 421 bp); E (4 108 bp); F (2 924 bp); 7: Negative.

圖1 病毒株各基因片段擴增結(jié)果

Fig.1 Results of RT-PCR

Fig.2 Mutation comparison of major antigenic sites of nucleoprotein

2.3.2 糖蛋白氨基酸分析 選擇來自不同地區(qū)不同動物的各種代表毒株進行糖蛋白主要抗原位點變異分析，結(jié)果見圖5(不包括最前面的19個信號肽)。分析發(fā)現(xiàn)：FJ008毒株糖蛋白主要抗原位點199由R 變成G，333位點為精氨酸。

2.4 全基因組同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 選取提交到GenBank的狂犬病毒全基因組序列28條，與本研究分離的FJ008的全基因組序列進行同源性比較。在核苷酸同源性的比較結(jié)果中，F(xiàn)J008與國內(nèi)河北、山東、山西、浙江、上海等省份的分離株的同源性均在99%以上，均屬基因I型。與西高加索的WCBV(尚未定基因型別)的同源性最低僅為62.54%。進行NJ系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析(圖6)，結(jié)果顯示這29株病毒可分為3個基因群， WCBV株為獨立一群，來自歐洲、澳洲和非洲的AF006497(澳大利亞)、NC009528(歐洲)、EU293120(南非)和NC009527(歐洲)等毒株為第二群，其余毒株均歸入第三群，第三群中FJ008與EU549783(河北)、JQ970486(山東)相當接近，處于同一聚簇內(nèi)親緣關系最近，為同一株型，其次是JQ970487(山西)、FJ712193(浙江)和GU345748(上海)株。

Fig.3 Mutation comparison of nucleoprotein Th-cell epitope

Fig.4 Mutation comparison of nucleoprotein B-cell epitope and phosphorylation site

3 討 論

狂犬病毒普遍流行于世界各地并通過家養(yǎng)或野生動物傳播，狂犬病毒分離株遺傳特征分析是了解病毒起源及傳播模式的重要工具[9]。近些年分子分析方法如反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和測序技術的發(fā)展，加速了RABV的分布及遺傳特性研究。分子流行病學分析所得的RABV基因數(shù)據(jù)庫的建立，能夠更精確的界定病毒類型并有助于追蹤RABV從受感染動物到人或其他動物的傳播[10]。

狂犬病毒的基因組大小約12 kb，為了獲得全長的cDNA，我們設計了6對引物進行分段擴增，6個擴增片段大小在532 bp～4 108 bp之間，各片段均與相鄰的片段存在一小部分重疊區(qū)，以保證覆蓋全長。氨基酸比較分析發(fā)現(xiàn)FJ008毒株糖蛋白主要抗原在199位點發(fā)生了R→G的突變，這在其它毒株中未發(fā)現(xiàn)，該突變是否為福建狂犬病毒的特征及其與毒力的相關性尚有待深入研究證實。

狂犬病病毒全基因組測序?qū)θ媪私獠《镜姆肿舆M化、基因調(diào)控和遺傳變異等具有重要意義，豐富狂犬病病毒的背景資料，為制定預防狂犬病政策或疫苗研制提供理論依據(jù)[11]。本研究進行的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析顯示福建首例狂犬病毒分離株FJ008與EU549783(河北)、JQ970486(山東)相當接近，處于同一聚簇內(nèi)親緣關系最近，為同一株型，其次是JQ970487(山西)、FJ712193(浙江)和GU345748(上海)株，均同屬于基因I型。我們首次獲得了福建省狂犬病毒的全基因組序列，盡管目前只有根據(jù)病毒序列推導病毒的生物學特征，同時由于缺乏更多的病毒序列信息，不能對病毒的進化進行更為深入的研究。但本研究將狂犬病毒的基因組分6段擴增，并分別進行克隆，為更進一步開展狂犬病毒相關的實驗室研究奠定了基礎，對于福建省今后狂犬病毒傳播來源和途徑等方面的研究具有重要意義。

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Sequencing and analysis of the complete genome of the first rabies virus isolate from Fujian, China

ZHANG Jian-ming1，WANG Yu-ping1，DENG Yan-qin2，WANG Ling-lan2，YAN Yan-sheng2

(1. Fujian International Travel Healthcare Center, Fuzhou 350001, China;2. Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350001, China)

In order to investigate gene sequences and evolution characteristics of rabies virus and provide theoretical information, the complete genome of the first rabies virus isolate from Fujian was sequenced and analyzed. In this study, we extracted viral RNA from cell culture directly, and then the segment RT-PCR were used for gene sequence amplification; thirdly, the obtained gene fragments were molecularly cloned and sequenced; at last, these fragments consisted of whole genome sequences were analyzed. The entire genome nucleotide sequence was obtained with no insertion and deletion in the coding region after the application of designed rabies primers. Mutations in the N protein antigenic sites occurred mainly in B-cell epitope a 379 V → L; the amino acid for glycoprotein antigenic sites I (231-bit) was L; antigenic site II 199 at sites R → G mutation occurred; antigenic site III 333 bit arginine (R). These results laid a foundation for further research on the mutation, dissemination, and mechanisms of rabies virus.

rabies virus; genome; sequence analysis

Yan Yan-sheng, Email:yysh@ fjcdc.com.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.004

嚴延生，Email：yysh@ fjcdc.com.cn

1.福建國際旅行衛(wèi)生保健中心，福州 350001； 2.福建省疾病預防控制中心，福州 350001

R373.9

A

1002-2694(2015)04-0311-04

2014-09-23；

2014-12-17

福建省自然科學基金(No.2012J05133)

Supported by grants from the Fujian Natural Science Foundation (No. 2012J05133)