姜 海，榮 蓉，田國忠，趙 娜，趙鴻雁，樸東日，趙赤鴻，崔步云

利用多重聚合酶鏈反應(yīng)和多色毛細(xì)管電泳分析布氏菌多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列

姜 海1，榮 蓉2，田國忠1，趙 娜1，趙鴻雁1，樸東日1，趙赤鴻2，崔步云1

目的 傳統(tǒng)的布魯氏菌多點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析方法涉及16個(gè)位點(diǎn)(MLVA-16)，包括單重聚合酶鏈反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，一直以來都作為標(biāo)準(zhǔn)的基因分型方法，用于布病的病原監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。然而，目前這種傳統(tǒng)方法工作量較大，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果不宜比較；尤其是對(duì)大規(guī)模菌株進(jìn)行基因分型或面臨突發(fā)疫情時(shí)，急需一種高通量且快速的方法。方法 用多重PCR和多色毛細(xì)管電泳方法建立一種可靠的，高通量的且自動(dòng)化程度較高的MLVA-16改良分型系統(tǒng)，用82株菌進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果 這種改良的MLVA-16分型系統(tǒng)具有很高的準(zhǔn)確性，且具有快速和高通量的特點(diǎn)。結(jié)論 改良的MLVA-16分型系統(tǒng)可用于基層布病實(shí)驗(yàn)室，為布病的病原監(jiān)測(cè)提供高效的工具。

多重PCR； 多色毛細(xì)管電泳； 布魯氏菌； 基因分型

布氏菌病(布病)是由布氏菌屬細(xì)菌侵人機(jī)體后引起傳染—變態(tài)反應(yīng)性人獸共患的傳染病[1-2]。人類及家畜、動(dòng)物普遍易感，患者很容易轉(zhuǎn)為難以治愈的慢性病人；動(dòng)物造成流產(chǎn)和不孕。布病遍布在世界上160多個(gè)國家，隨著全球化的影響，布病疫情發(fā)生了很多變化。一些國家布病再次出現(xiàn)，一些國家疫情愈演愈烈，尤其在地中海、中東、西亞、非洲和南美洲。中國每個(gè)省(市)區(qū)的人畜中幾乎都有不同程度布病的存在和流行[3]。布病是《中華人民共和國傳染病防治法》37種傳染病中的乙類傳染病。自建國以來，中國經(jīng)歷了對(duì)布病疫情調(diào)查、流行病學(xué)規(guī)律的探索和分析、全面開展了預(yù)防和控制措施以及重點(diǎn)專項(xiàng)問題研究。在許多方面取得了顯著成績(jī)和進(jìn)展。但是鑒于布病發(fā)病特點(diǎn)，近15年疫情呈持續(xù)增長態(tài)勢(shì)，愈演愈烈。目前，布病在中國已經(jīng)是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，預(yù)防和控制人畜布病成為一項(xiàng)迫在眉睫的重要工作。

確認(rèn)布氏菌種(型)對(duì)于疫情判斷及流行病學(xué)溯源分析極為重要。因此，開展布病爆發(fā)流行的追蹤、溯源是布病預(yù)防控制技術(shù)支撐體系中亟須解決的問題。根據(jù)宿主偏好、致病力及流行病學(xué)特性，目前布氏菌屬已擴(kuò)展為10個(gè)種[4-5]。分別是羊種(共3個(gè)型)、牛種(共8個(gè)型)、豬種(共5個(gè)型)、綿羊附睪種、犬種、沙林鼠種、2種新的海洋哺乳動(dòng)物種(鯨、鰭)、田鼠種和Brucellainopinata種。傳統(tǒng)的生物型鑒定只能鑒定到種(型)，無法對(duì)菌株進(jìn)行溯源分析。一些低分辨率的分子分型方法，如PCR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)[6]、腸桿菌基因問重復(fù)序列(ERIC-PCR)[7]、基因外重復(fù)回文序列(REP-PCR)[8]隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD-PCR)[9]和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)[10]在分子流行病學(xué)中應(yīng)用價(jià)值又十分局限。由于布氏菌屬種間DNA同源性高達(dá)90%，亟須一種高分辨力的分型方法用來提供疾病傳播模式和分子流行病學(xué)信息。多位點(diǎn)序列分析[11]和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)[12]應(yīng)運(yùn)而生，然而這些方法都存在有限的菌株間區(qū)分能力，無法對(duì)某一疫區(qū)間進(jìn)行菌株流行病學(xué)關(guān)聯(lián)追蹤調(diào)查。多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)[13]是一個(gè)基于PCR技術(shù)的分型方法。該方法通過區(qū)分基因組上多個(gè)具有多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)(VNTR)的重復(fù)數(shù)來區(qū)分菌株。串聯(lián)重復(fù)數(shù)不同的核酸片段經(jīng)位于串聯(lián)重復(fù)的兩端引物擴(kuò)增，通過瓊脂糖電泳、測(cè)序或毛細(xì)管電泳確定擴(kuò)增產(chǎn)物大小，進(jìn)而確定串聯(lián)重復(fù)數(shù)。此方法分辨率高、重復(fù)性好、快速、簡(jiǎn)便，可用于流行病學(xué)溯源分析。

MLVA數(shù)據(jù)可以通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳很容易地產(chǎn)生， 但實(shí)驗(yàn)室之間的比較仍然是個(gè)問題，因?yàn)榄傊悄z電泳無法解決某些特定位點(diǎn)模棱兩可的片段大?。欢疫@種方法工作量較大，尤其是對(duì)大規(guī)模菌株進(jìn)行基因分型或面臨突發(fā)疫情時(shí)，急需一種高通量且快速的方法。在這篇研究中，我們利用多重PCR和多色毛細(xì)管電泳方法建立一種可靠的，自動(dòng)化程度高且高通量的MLVA-16改良分型方法。本研究對(duì)4株標(biāo)準(zhǔn)菌株、34株流行羊種菌、17株流行牛種菌、18株流行豬種菌和9株流行犬種菌株進(jìn)行改良的MLVA分析，驗(yàn)證了該方法的可靠性和準(zhǔn)確性，為布病的病原監(jiān)測(cè)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 布氏菌菌株 本實(shí)驗(yàn)選用的標(biāo)準(zhǔn)菌株(16M、544A、1330S和RM6/66)及地方菌株(23株羊種3型、5株牛種1型、12株牛種3型、12株豬種1型、7株豬種3型和9株犬種菌)均來自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所布魯氏菌病室。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與基因組DNA的提取 將凍干菌株在布魯桿菌瓊脂斜面上復(fù)蘇后，參照標(biāo)準(zhǔn)菌株做硫堇、復(fù)紅染料抑菌實(shí)驗(yàn)和噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)。用熱滅活的方式滅活細(xì)菌，然后用基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA?；蚪M的提取按試劑盒說明書進(jìn)行。提取的基因組DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16個(gè)位點(diǎn)多重PCR和多色毛細(xì)管分析方法 所用引物序列參照參考文獻(xiàn)，多重PCR組合及多色毛細(xì)管分析信息見表2。引物由北京擎科新業(yè)生物公司合成，并分別在各上游引物5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)。見表1。

1.3.1 目的VNTR 位點(diǎn)擴(kuò)增 采用多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)( PCR) 擴(kuò)增各VNTR 位點(diǎn)。1)反應(yīng)體系:4套多重PCR均采用30 μL反應(yīng)體系，包括2×EasyTaqPCR Super Mix:15 μL，4對(duì)混合引物(10 μm)2 μL，DNA模板(100 ng)2 μL，12 μL去離子水。 2)擴(kuò)增條件: 預(yù)變性96 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 90 s、72 ℃30 s， 35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。每次擴(kuò)增均以16M作陽性對(duì)照。

1.3.2 擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)與分析 PCR 產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，采用ABI 3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳; 根據(jù)GeneScan 1200 LIZ DNA Marker確定擴(kuò)增產(chǎn)物大小，采用Gene-Mapper 4.0軟件進(jìn)行分析并計(jì)算檢測(cè)位點(diǎn)中各VNTR 的重復(fù)次數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 4株標(biāo)準(zhǔn)株16個(gè)VNTR位點(diǎn)毛細(xì)管電泳觀察值與測(cè)序預(yù)期值比較 毛細(xì)管電泳分析VNTR片段的大小具有可重復(fù)性，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因長度大小通過對(duì)其進(jìn)行直接測(cè)序來驗(yàn)證(表2)。通過毛細(xì)管電泳分析獲得的VNTR片段的大小，與預(yù)期的片段大小具有較低的標(biāo)準(zhǔn)差， 無需修改相應(yīng)的等位基因串聯(lián)重復(fù)數(shù)目。

2.2 部分菌株部分VNTR位點(diǎn)多重PCR擴(kuò)增后毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果 菌株2011030多重PCR3bruce18(藍(lán)色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產(chǎn)物大小分別為136 bp、460 bp、229 bp和345 bp。菌株2011032多重PCR1bruce18(藍(lán)色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產(chǎn)物大小分別為124 bp、320 bp、363 bp和150 bp。菌株2010028多重PCR4 bruce18(藍(lán)色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產(chǎn)物大小分別為150 bp、246 bp、122 bp和185 bp。菌株2010022多重PCR2 bruce18(藍(lán)色)、bruce21(紅色) 、 bruce55(綠色) 、 bruce04(黑色)產(chǎn)物大小分別為177 bp、289 bp、310 bp和39 1bp。毛細(xì)管電泳檢測(cè)峰圖分別見圖1、圖2、圖3和圖4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株結(jié)果，證實(shí)了待檢菌株VNTR重復(fù)數(shù)的準(zhǔn)確性。

2.3 16個(gè)位點(diǎn)不同等位基因擴(kuò)增后毛細(xì)管電泳分析的測(cè)量誤差 16個(gè)位點(diǎn)不同等位基因擴(kuò)增后毛細(xì)管電泳分析的測(cè)量誤差見表4，標(biāo)準(zhǔn)差范圍在0.03～0.23之間，證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性。

表3 16個(gè)位點(diǎn)不同等位基因擴(kuò)增后毛細(xì)管電泳分析的測(cè)量誤差

Tab.3 Variability in VNTR fragment measurements

3 討 論

MLVA方法是一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的方法，其操作簡(jiǎn)單、分辨率高、結(jié)果分析容易、具有很高的重復(fù)性、并能夠提供數(shù)字化的分型信息，適宜進(jìn)行大量樣本和網(wǎng)絡(luò)化分析。更重要的是，根據(jù)基因型特征型別的簇，提出預(yù)警信息，進(jìn)而結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)暴發(fā)關(guān)聯(lián)。尤其是發(fā)現(xiàn)散在分布于不同地理區(qū)域的暴發(fā)關(guān)聯(lián)，查找危險(xiǎn)因素，明確傳播途徑，追溯傳染來源，為布病跨地區(qū)傳播菌株溯源和疾病控制提供可靠技術(shù)支撐。MLVA在揭示菌株間遺傳關(guān)系及流行病溯源調(diào)查中的意義在我們發(fā)表的多篇文章中已有闡述[14-16]，本研究已不再贅述，在此僅對(duì)方法學(xué)進(jìn)行評(píng)述。

MLVA分析已經(jīng)成功地在許多細(xì)菌中廣泛應(yīng)用，包括所有涉及生物恐怖的致病菌如炭疽桿菌[17]和鼠疫耶爾森菌[18]。對(duì)于這些病原體，通過毛細(xì)管電泳估計(jì)VNTR片段大小是公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于布魯氏菌，瓊脂糖電泳估計(jì)VNTR片段大小是最廣泛使用的MLVA分析方法。該傳統(tǒng)方法便宜但相對(duì)耗時(shí)，不適于在疫情嚴(yán)重的省份進(jìn)行大規(guī)模菌株基因分型。在這樣的背景下，采用新的高通量MLVA分型系統(tǒng)迫在眉睫。此外，這將允許實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)使用傳統(tǒng)的MLVA-16分型方案，并及時(shí)拓展了當(dāng)前國際數(shù)據(jù)庫的疫情數(shù)據(jù)。本研究中的數(shù)據(jù)也可以用于其他實(shí)驗(yàn)室菌株MLVA數(shù)據(jù)的參考，從而提高了分析的重現(xiàn)性。另外，預(yù)期值與觀察值之間存在很小的差異，不同菌株相同位點(diǎn)相同等位基因存在很小的標(biāo)準(zhǔn)差(表3)都證實(shí)了改良后該方法的準(zhǔn)確性。當(dāng)有新的疫情出現(xiàn)時(shí)，甚至涉及潛在的生物恐怖重大事件時(shí)，用改良的MLVA分型系統(tǒng)將成為應(yīng)對(duì)這些事件的強(qiáng)有力工具。

隨著我國人間和畜問布病疫情持續(xù)快速上升。建立適于省級(jí)疾病預(yù)防控制(地方病)中心標(biāo)準(zhǔn)化的分子分型技術(shù)進(jìn)行布氏菌分子流行病學(xué)研究，闡明布氏菌疫區(qū)基因型特征并揭示其流行病學(xué)相關(guān)性已迫在眉睫。布氏菌分子分型監(jiān)測(cè)是未來我國布病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)監(jiān)測(cè)的發(fā)展方向，是我國布病預(yù)防控制的關(guān)鍵支撐技術(shù)，也是我國公共衛(wèi)生應(yīng)急體系的重要組成部分，為提高和擴(kuò)展布病防控能力提供新模式。布魯氏菌也可以被恐怖分子用來發(fā)動(dòng)生物恐怖襲擊，因此生物反恐和防恐是保障我國安全的重要措施之一。為了快速、有效、經(jīng)濟(jì)地預(yù)防和控制布魯氏菌的大面積暴發(fā)和流行，建立有效的病原微生物調(diào)查及溯源研究方法及深入了解布魯氏菌致病相關(guān)機(jī)制具有重要的作用。鑒于MLVA技術(shù)基于PulseNet標(biāo)準(zhǔn)化方案，可以作為細(xì)菌分子分型、基因組進(jìn)化、分子流行病學(xué)研究、實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)以及相關(guān)科研的有力工具，改良的MLVA分型系統(tǒng)可以作為布魯氏菌流行病學(xué)調(diào)查中最重要的手段之一。

[1]Gvizdic S, Cengic D, Bratic M, et al.Brucellamelltemis: review of the human infection case[J]. Bosh J Basic Med Sci, 2006, 6(1): 15-18.

[2]Cui BY. Epidemic surveilance and control of brucellosis in China[J]. Dis Surveill, 2007, 22(10): 649-651. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2007.10.001 (in Chinese) 崔步云．中國布魯菌病疫情監(jiān)測(cè)與控制[J]．疾病監(jiān)測(cè)，2007, 22(10)：649-651．

[3]Scholz HC, Hubalek Z, Sedlacek I, et al.Brucellamicrotisp. nov., isolated from the common voleMicrotusarvalis[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2008, 58: 375-382. DOI: 10.1099/ijs.0.65356-0

[4]Scholz HC, Nockler K, Gollner C, et al.Brucellainopinatasp. nov., isolated from a breast implant infection[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60: 801-808. DOI:10.1099/ijs.0.011148-0

[5]AI Dabouk S, Tomaso H, Prenger-Beminghoff E, et al. Identification ofBrucellaspecies and biotypes using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PERRFLP)[J]. Crit Rev Microbiol, 2005, 31(4): 191-196.

[6]Mercier E, Jumas-Bilak E, Allardet-Servent A, et al. Polymorphism inBrucellastrains detected by studying distribution of two short repetitive DNA elements[J]. J Clin Microbiol, 1996, 34(5): 1299-1302.

[7]Tcherneva E, Rijpens N, Naydensky C, et al. Repetitive element sequence based polymerase chain reaction for typing ofBrucellastrains[J]. Vet Microbiol, 1996, 51(1-2): 169-178.

[8]Tcherneva E, Rijpens N, Jersek B, et al. Differentiation ofBrucellaspecies by random amplified polymorphic DNA analysis[J]. J Appl Microbiol, 2000, 88(1): 69-80.

[9]Whatmore AM, Murphy TJ, Shankster S,et al. Use of amplified fragment length polymorphism to identify and typeBrucellaisolates of medical and veterinaryinterest[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(2): 761-769.

[10]Whatmore AM, Perrett LL, MacMillan AP. Characterisation of the genetic diversity ofBrucellaby multilocus sequencing[J]. BMC Microbiol, 2007, 20(7): 34.

[11]Allardet-Servent A, Bourg G, Ramuz M, et al. DNA polymorphism in strains of the genusBrucella[J]. J Bacteriol, 1988, 170(10): 4603-4607.

[12]Le Fleche P, Jacques I, Grayon M, et al. Evaluation and selection of tandem repeat loci for aBrucellaMLVA typing assay[J]. BMC Microbiol, 2006, 9(6): 9.

[13]Di D, Cui B, Wang H, et al. Genetic polymorphism characteristics ofBrucellacanisisolated in China[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e84862. DOI: 10.1371/journal.pone.0084862

[14]Jiang H, Wang H, Xu L, et al. MLVA genotyping ofBrucellamelitensisandBrucellaabortusisolates from different animal species and humans and identification ofBrucellasuisvaccine strain S2 from cattle in China[J]. PLoS One, 2013, 8(10): e76332. DOI: 10.1371/journal.pone.0076332

[15]Jiang H, Fan M, Chen J, et al. MLVA genotyping of Chinese humanBrucellamelitensisbiovar 1, 2 and 3 isolates[J]. BMC Microbiol, 2011, 11: 256. DOI: 10.1186/1471-2180-11-256

[16]Jiang H, Mao LL, Zhao HY, et al. Reemergence and genetic comparison ofBrucellacanisin China, using a multiple-locus variable-number tandem-repeat assay[J]. Vet Microbiol, 2012, 154(3/4): 419-421. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.07.014

[17]Li S, An X, Huang Y, et al. Source tracking of an anthrax outbreak in northeastern China using complete genome analysis and MLVA genotyping[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014. [Epub ahead of print]

[18]Zhang X, Hai R, Wei J, et al. MLVA distribution characteristics ofYersiniapestisin China and the correlation analysis[J]. BMC Microbiol, 2009, 9: 205. DOI: 10.1186/1471-2180-9-205

MLVA-16 loci panel on Brucella spp. using multiplex PCR and multicolor capillary electrophoresis

JIANG Hai1,RONG Rong2,TIAN Guo-zhong1,ZHAO Na1,ZHAO Hong-yan1,PIAO Dong-ri1,ZHAO Chi-hong2,CUI Bu-yun1

(1. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China；2. Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

The Multi Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis 16 loci panel (MLVA-16), involving singleplex PCRs and agarose gel electrophoresis, is the standard genotyping method forBrucellaspp. used also for theBrucellainternational online database. To find a rapid and through-put genotyping method, modified MLVA-16 can be used. We described an alternative, reliable, high-throughput MLVA-16 protocol using multiplex PCRs and multicolor capillary electrophoresis. Furthermore, 82Brucellastrains were tested. Results showed that the modified MLVA-16 has proved to be accurate, rapid and throughput. It's indicated that the modified MLVA-16 is highly discriminatory and epidemiological concordance and is easy for brucellosis surveillance in province-level laboratory.

multiplex PCR; multicolor capillary electrophoresis;Brucella; genotyping

CUI Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn; ZHAO Chi-hong, Email: zhaoch@chinacdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.003

國家自然科學(xué)基金 (No.81271900)；國家衛(wèi)生計(jì)生委公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No. 201302006)；重大專項(xiàng)(No. 2012ZX10004215)

崔步云，Email：cuibuyun@icdc.cn； 趙赤鴻，Email：zhaoch@chinacdc.cn

1.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,傳染病預(yù)防控制圍家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,感染性疾 病協(xié)同診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206 ； 2.中國疾病預(yù)防控制中心，北京 102206

R378.5

A

1002-2694(2015)04-0303-08

2014-10-13；

2014-12-06

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No.81271900)；the Special Scientific Research Fund of Public Welfare Profession of China (No. 201302006)；the Major Specil Fund(No. 2012ZX10004215)