許 艷，陳海麗，劉曉茜，熊延青，席秀紅，宰淑蓓，蔡金鳳，盧水華，朱召芹

CFP10-ESAT6融合蛋白用于結(jié)核分枝桿菌感染診斷ELISA方法的初步研究

許 艷，陳海麗，劉曉茜，熊延青，席秀紅，宰淑蓓，蔡金鳳，盧水華，朱召芹

目的 制備結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白，探討CFP10-ESAT6融合蛋白在結(jié)核分枝桿菌免疫診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 PCR擴(kuò)增得到CFP-10、ESAT6基因片斷，將其先后克隆入pET-28a表達(dá)載體。優(yōu)化表達(dá)條件、用鎳親和層析的方法純化帶His標(biāo)簽的重組CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制備兔多克隆抗體，建立rCFP10-ESAT6為抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法，以健康者血清為對(duì)照，檢測(cè)170例結(jié)核患者血清的抗體。結(jié)果 重組質(zhì)粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因測(cè)序結(jié)果與預(yù)計(jì)設(shè)計(jì)完全一致。融合蛋白在E.coliBL21(DE3)工程菌中均為可溶性表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的40%。利用金屬螯合親和層析直接純化重組蛋白，純度達(dá)到95%以上。Western blot分析表明，重組蛋白能與結(jié)核患者血清發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，與健康者血清不發(fā)生反應(yīng)。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗體的效價(jià)為1∶8 000，CFP10-ESAT6作為包被抗原的檢測(cè)結(jié)核病人血清中特異性抗體的間接ELISA最佳包被濃度為0.002 μg/mL，患者血清的最佳稀釋度為1∶500。檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷的符合率，ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。結(jié)論 CFP10-ESAT6融合蛋白具有較高的抗原特異性和免疫反應(yīng)性，有可能成為結(jié)核病免疫學(xué)診斷的特異抗原，對(duì)結(jié)核的診斷具有重要參考價(jià)值。

結(jié)核分枝桿菌；CFP10-ESAT6；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染病，是危害人類健康的重要傳染病之一。控制結(jié)核病的流行與蔓延的關(guān)鍵在于找到簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷方法[1-3]。雖然細(xì)菌學(xué)檢查仍是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于涂片陽(yáng)性率較低，培養(yǎng)又需時(shí)太久，所以發(fā)展免疫學(xué)診斷對(duì)結(jié)核病的診斷具有重要參考價(jià)值[3，8]。

目前臨床上使用ELISA診斷方法的特異性較差，主要原因是現(xiàn)行的ELISA方法無法區(qū)分致病性結(jié)核桿菌感染和BCG接種者[4-5]?？ń槊缂捌渌侵虏⌒苑种U菌中不存在RD1區(qū)，因此RD1區(qū)基因所編碼的蛋白在結(jié)核分枝桿菌疫苗研制開發(fā)和檢驗(yàn)診斷方面都受到了廣泛的關(guān)注。CFP10和ESAT6的編碼基因均位于RD1區(qū)，是重要的T細(xì)胞抗原，具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，且具有強(qiáng)烈的免疫原性，成為研究結(jié)核病診斷與預(yù)防的熱點(diǎn)[6，9-10]。因此可將CFP10和ESAT6作為診斷結(jié)核桿菌感染的特異性試劑[7，11]。

由于單一蛋白在診斷上靈敏度較差，因此我們通過基因工程的方法在大腸桿菌中表達(dá)了重組融合蛋白CFP10-ESAT6，建立檢測(cè)人血清中抗結(jié)核桿菌抗體的間接ELISA方法，并探討CFP10-ESAT6融合蛋白在結(jié)核分支桿菌免疫診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、質(zhì)粒與菌株 結(jié)核分支桿菌H37Rv、大腸工程菌TOP10、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室是保存，pET28a(+)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自Novagen(USA)。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶NdeI、BamH I、SacI和HindⅢ、PCR相關(guān)試劑及DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；IPTG購(gòu)自捷瑞生物公司；抗His-tag單克隆抗體及蛋白質(zhì)純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司；除鹽柱購(gòu)自Millipore公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)自Sigma公司；羊抗人二抗購(gòu)自Proteintech group公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 結(jié)核免疫診斷試劑 奧普結(jié)核分枝桿菌抗體膠體金法診斷試劑盒購(gòu)自上海奧普生物技術(shù)有限公司，操作按診斷試劑說明書進(jìn)行。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性新西蘭大白兔1只，質(zhì)量3 kg左右,來自上海市公共衛(wèi)生臨床中心動(dòng)物中心。

1.1.5 血清 血清取至上海市公共衛(wèi)生臨床中心住院患者，TB并排除HIV感染病人血清170例。查閱病例病史，入選TB病例均符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒布的《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》所規(guī)定結(jié)核病病例診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要為痰涂片結(jié)果、痰培養(yǎng)結(jié)果、影像學(xué)結(jié)果、入院診斷、初步診斷及出院診斷等相關(guān)病史，并參照前期ELISPOT檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分組[14]。在研究的170位病例中，明確診斷陽(yáng)性：即痰涂片或痰培養(yǎng)陽(yáng)性55人，痰涂片或痰培養(yǎng)均陰性，但胸x線片有肺結(jié)核特征病灶的有53人，故傳染性肺結(jié)核診斷明確的有108人；痰涂片和痰培養(yǎng)陰性，但具備菌陰性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)1～6中3項(xiàng)或7～8條中任何1項(xiàng)的有22人；排除結(jié)核病的有40人。同時(shí)，選取婦產(chǎn)科排除TB病例60例作為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增目的基因 實(shí)驗(yàn)用到的引物見表1。引物由上海生工生物工程公司合成，擴(kuò)增條件為：94℃ 預(yù)變性5 min， 94 ℃,30 s；55 ℃,30 s；72 ℃, 45 s，共30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-CFP10-ESAT6的構(gòu)建 用Qiagen PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化CFP10和ESAT6表達(dá)片段PCR產(chǎn)物，分別連入pMD18-T 載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒、酶切和測(cè)序鑒定。用NdeI和HamH I雙酶切pET28a(+)和pMD18-T-CFP10重組質(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒、酶切和測(cè)序鑒定。SacI和HindⅢ雙酶切pMD18-T-ESAT6和pET28a-CFP10，回收ESAT6片斷與線性化的載體pET28a-CFP10,連接后轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3 重組融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a-CFP10-ESAT6轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單克隆接種于5 mL含卡那霉素的LB中37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h后離心收集菌體。洗滌后重懸菌體沉淀，用超聲破碎細(xì)菌，離心后分別取少量上清與沉淀SDS-PAGE檢測(cè)。并用Western-Blotting的方法進(jìn)行蛋白鑒定。

1.2.4 重組蛋白純化和多抗制備 用Novagen 的試劑盒純化蛋白，純化方法及過程見操作手冊(cè)，并經(jīng)除鹽柱除鹽。以Novagen蛋白純化試劑盒中的Binding Buffer做對(duì)照，用nanodrop1000儀器測(cè)定純化蛋白濃度，然后用Binding Buffer稀釋成使用濃度為1mg/mL。將不完全弗氏佐劑和融合蛋白CFP10-ESAT6(1 mg/mL)各0.5 mL混合,分別于第0周、2周、4周、6周采用背部皮下多點(diǎn)注射的免疫方式，6周后從耳靜脈采血，間接ELISA測(cè)效價(jià)為1∶16 000時(shí)心臟采血，分離血清備用。

1.2.5 間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè) 以不同濃度的重組蛋白CFP10-ESAT6作為包被抗原，并且用免疫家兔獲得的抗CFP10-ESAT6的多克隆抗體血清作為陽(yáng)性血清，正常人血清作為陰性血清，倍比稀釋后進(jìn)行方陣滴定。尋找最佳的抗原包被濃度、患者血清的最佳稀釋、最佳封閉條件，根據(jù)結(jié)果確定ELISA最佳反應(yīng)條件。倍比稀釋重組蛋白CFP10-ESAT6加入ELISA檢測(cè)板中，每孔100 μL，37 ℃包被2 h；棄去孔內(nèi)的液體，用1×PBST洗滌液洗滌5次，每次5次；每孔加200 μL含5%脫脂乳的PBS，37 ℃封閉2 h；拍干，每孔加入倍比稀釋100 μL患者血清，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗人第二抗體(1∶2 500稀釋)，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入新鮮配制的底物液，每孔加100 μL，避光反應(yīng)15 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取OD490值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)比融合蛋白ELISA試劑盒檢測(cè)的靈敏度和特異度，且應(yīng)用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件，分別采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)和普通卡方檢驗(yàn)對(duì)各組檢出陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增和誘導(dǎo)表達(dá)鑒定 CFP10與ESAT6擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與預(yù)期一致，見圖1。融合蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行12% SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量24 kD處可見一明顯蛋白表達(dá)條帶(圖2)。用抗His抗體Western blot檢測(cè)目的蛋白，無非特異性條帶出現(xiàn)(圖2)。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified product of target genes

2.2 融合蛋白純化 將誘導(dǎo)后的表達(dá)菌，集菌后冰上超聲裂解，將全菌、超聲后的菌液上清、超聲后的菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。目的蛋白存在于上清中，說明重組蛋白CFP10-ESAT6為可溶性表達(dá)。將超聲后的裂菌上清用試劑盒按照試劑盒說明書經(jīng)Ni2+親和層析對(duì)蛋白進(jìn)行純化，并收集過程中的緩沖液，分別SDS-PAGE，確定純化效率(圖4)。

M: Protein maker; 1: BL-21; 2: pET28a; 3: CFP10-ESAT6.

圖3 目的蛋白Western-Blot驗(yàn)證

Fig.3 Western-Blot verification for targeted protein

M: Protein maker; 1: Whole-cell protein; 2: Supernatant after ultrasound; 3: Ultrasound after precipitation; 4: Flowthrough liquid; 5: Binding buffer; 6: Washing liquid; 7: Eluate was purified protein.

圖4 融合蛋白純化

Fig.4 Fusion protein purification

2.3 融合蛋白純化后除鹽濃縮 用Millpore的除鹽柱除鹽后作12%SDS-PAGE可見純度較高的蛋白條帶。

M: Protein maker; 1-3: Desalted protein.

圖5 純化后用millpore的除鹽柱除鹽

Fig.5 Purified CFP10-ESAT6 was desalinated using a millpore desalting column

2.4 間接ELISA檢測(cè)方法的應(yīng)用 選取170例確診結(jié)核患者和60份健康患者的血清[15]，利用棋盤法，將不同稀釋度蛋白濃度包被后(包被液為5%脫脂乳)，加入不同稀釋度確診患者和健康血清，根據(jù)檢測(cè)ELSIA孔結(jié)果的讀取值比較，確定融合蛋白CFP10-ESAT6的最佳包被濃度為0.002 μg/mL，患者血清的最佳稀釋度為1∶500稀釋。

2.5 CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA檢測(cè)方法比較

2.5.1 總體陽(yáng)性率比較 在130位病例中，用CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)，陽(yáng)性87例，陰性27例，無法判斷16例；用商品化的膠體金試劑盒檢測(cè)，陽(yáng)性79例，陰性51例，其陽(yáng)性檢出率分別為66.92%和55.39%。而ELISPOT檢測(cè)陽(yáng)性109例，陰性17例，無法判斷4例，總體陽(yáng)性檢出率為83.84%(見表2)。

表2 ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和膠體金檢測(cè)結(jié)果

Tab.2 Outcome of ELISPOT, ELISA (rCFP10-ESAT6) and Colloidal gold

2.5.2 ELISPOT和ELISA診斷結(jié)果與明確診斷的符合程度對(duì)比 ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和膠體金方法分別與臨床明確診斷的符合率分別為85.22%(n=196，196/230)、71.30%(n=164，164/230)和62.61%(n=144，144/230)，檢測(cè)結(jié)果與臨床明確診斷的符合率為，ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>膠體金。ELISPOT的靈敏度和特異度分別為86.51%和95.60%，ELISA(rCFP10-ESAT6)的靈敏度和特異度分別為76.32%和90.58%，膠體金的靈敏度和特異度分別為55.38%和86.74%。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌區(qū)別于卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)的重要特征是致病性結(jié)核分枝桿菌存在RD1區(qū)，而卡介苗及其它非致病性分枝桿菌中不存在。RD1區(qū)基因所編碼的蛋白在結(jié)核分枝桿菌疫苗研制開發(fā)和檢驗(yàn)診斷方面都受到了廣泛的關(guān)注。大量研究表明CFP-10和ESAT-6這兩種小分子蛋白具有很強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性,在感染早期,T細(xì)胞識(shí)別這兩個(gè)抗原,介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，成為研究結(jié)核病診斷與預(yù)防的熱點(diǎn)[6，9-10]。CFP10與ESAT6有豐富的抗原表位，作為結(jié)核感染的診斷抗原具有明顯的優(yōu)勢(shì)[9-13]，CFP10與ESAT6抗原在人和牛結(jié)核分枝桿菌感染診斷中均有較高的特異性和敏感性[11-13]。

由于CFP10和EAST6是結(jié)核桿菌早期感染導(dǎo)致宿主產(chǎn)生的兩種分泌性小分子蛋白，為了增加蛋白的免疫原性，本實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中成功表達(dá)了融合蛋白CFP10-ESAT6，用此蛋白免疫家兔，獲得高效價(jià)抗CFP10-ESAT6多克隆抗體，建立以間接ELISA為基礎(chǔ)的結(jié)核抗體檢測(cè)方法。在170份確診結(jié)核患者血清和60例健康血清進(jìn)行檢測(cè)后[14]，確定最佳抗原包被濃度為0.002 μg/mL和最佳血清稀釋度為1∶500。

本研究發(fā)現(xiàn)，ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和膠體金方法分別與臨床明確診斷的符合率分別為85.22%(n=196，196/230)、71.30%(n=164，164/230)和62.61%(n=144，144/230)，三種方法的檢測(cè)結(jié)果與臨床明確診斷的符合率為ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>膠體金。ELISPOT的靈敏度和特異性分別為86.51%和95.60%，ELISA(rCFP10-ESAT6)的靈敏度和特異性分別為76.32%和90.58%，膠體金的靈敏度和特異度分別為55.38%和86.74%。因此，融合蛋白rCFP10-ESAT6和靈敏度和特異性均優(yōu)于商品化的膠體金試劑盒。

ELISA也存在一定比例的假陽(yáng)性與假陰性，可能與下列因素有關(guān)：如結(jié)核桿菌型別不同，故可能局限部分檢出率。而假陽(yáng)性可能是因?yàn)橛行┤诉^去感染過結(jié)核桿菌或其它非特異性物質(zhì)的干擾。為了更好的對(duì)該診斷方法進(jìn)行評(píng)估，我們選取確診結(jié)核患者血清和健康血清，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作中的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，綜合判斷，確定最佳檢測(cè)參數(shù)。

結(jié)果表明，來源于結(jié)核桿菌RD1區(qū)的重組CFP10-ESAT6融合蛋白有望開發(fā)為結(jié)核血清學(xué)診斷用新抗原。

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Usage of CFP10-ESAT6 fusing protein as a ELISA diagnostic method for TB

XU Yan,CHEN Hai-li,LIU Xiao-qian,XIONG Yan-qing,XI Xiu-hong,ZAI Shu-bei,CAI Jin-feng,LU Shui-hua,ZHU Zhao-qin

(Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China)

In this study, we prepared theMycobacteriumtuberculosisCFP10-ESAT6 fusion protein and evaluate its potential value for immunodiagnosis of tuberculosis. Thecfp-10 andesat6 gene fragments were amplified respectively and cloned into the pET-28a expression vector. Optimized the expression conditions, His-tagged recombinant CFP10-ESAT6 protein (rCFP10-ESAT6) was purified using nickel affinity chromatography. Rabbit polyclonal antibody was prepared to establish rCFP10-ESAT6 antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. We detected 170 tuberculosis sera antibodies and 60 health sera as negative control. Results showed that the recombinant plasmid pET28a-CFP10-ESAT6 target gene sequencing results consisted with the expected design. Soluble expression CFP10-ESAT6 was accounted for 40% of the total bacterial protein inE.coliBL21 (DE3). We used metal chelate affinity chromatography to purify the recombinant proteins directly, which was over 90% purity. Western blot analysis showed the recombinant protein in TB patient sera with specific immune response. CFP10-ESAT6 rabbit polyclonal antibody was in a titer of 1∶8 000. The optimal coating concentration of CFP10-ESAT6 as coating antigen-specific antibodies in serum indirect ELISA was 0.002 μg/mL and the optimal serum dilution was 1∶500. Results' consistency with clinical diagnosis of three methods was ELISPOT>ELISA (rCFP10-ESAT6)>colloidal gold. We established an indirect ELISA method that CFP10-ESAT6 as a coating antigen for TB antibodies in human serum. CFP10-ESAT6 fusion protein was efficiently expressed in pET28a-CFP10-ESAT6/BL21 (DE3), which may be a potential immunological diagnosis of tuberculosis-specific antigens.

Zhu Zhao-qin; Email:zhaoqinzhu@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.005

上海市衛(wèi)生局面上基金(No.20124467)，國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(No.31200108)，十二五科技重大專項(xiàng)(No.2013ZX10004-221和2013ZX10004221-004)

朱召芹，Email：zhaoqinzhu@163.com

上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508

R378.91

A

1002-2694(2015)04-0315-05

2014-05-30；

2015-01-12