王征樺，吳守麗，張春陽，顏蘋蘋

2008-2013年福建省HIV-1毒株耐藥基因變異研究

王征樺，吳守麗，張春陽，顏蘋蘋

目的 分析2008-2013年福建HIV-1毒株耐藥基因變異情況。方法 收集2008-2013年福建省病毒載量大于1 000 copy/mL艾滋病患者，采用自建HIV-1基因型耐藥檢測進(jìn)行耐藥檢測和分析。結(jié)果 共收集226例病毒載量大于1 000 copy/mL樣本，平均載量值1.62×105copy/mL；124例樣本擴增及測序后獲得蛋白酶以及部分反轉(zhuǎn)錄酶基因序列，亞型分析顯示92例(74.2%)為CRF_01AE亞型，14例(11.3%)為B亞型，C和BC亞型各有7例，另4例為其他亞型。77對反轉(zhuǎn)錄酶以及蛋白酶抑制劑有不同程度耐藥；對核苷類和非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥分別有63例(50.8%)和74例(59.7%)，對蛋白酶抑制劑耐藥9例(7.3%)；核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要耐藥突變包括了M184V、M41L、D67N、L70R、T219F、K219Q等，造成對3TC、AZT、D4T等不同程度耐藥；非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制主要耐藥突變包括K101E、Y181C、K103N、G190A等，造成對NVP和EFV不同程度耐藥。結(jié)論 福建省HIV-1感染者總體耐藥率較低，但是隨著治療人數(shù)增加以及治療時間延長，對反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑出現(xiàn)較高程度耐藥，仍需加強艾滋病患者耐藥檢測。

人類免疫缺陷病毒；抗病毒治療；耐藥；基因突變

自20世紀(jì)90年代中期全球開展艾滋病高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active anti-retrovirus therapy，HAART)以來，它使艾滋病從一個被稱之為死亡率最高的疾病，變成了一個可治療的慢性病，挽救了大量患者的生命，并提高患者的生存質(zhì)量[1-2]。但是由于HIV-1的高度變異性以及藥物選擇壓力等原因使HIV病毒在快速復(fù)制的過程中出現(xiàn)耐藥性[3]，從而影響治療效果。福建省從2005年初開始免費抗病毒治療，長期的抗病毒治療必定導(dǎo)致耐藥性毒株的發(fā)生和流行，及時了解和掌握HIV毒株的耐藥性演變及進(jìn)化的規(guī)律，有助于減少HIV耐藥的產(chǎn)生，為我省制訂抗病毒治療計劃和HIV耐藥預(yù)防措施提供依據(jù)。為此，本次研究收集2008-2013年福建省HIV-1病毒載量檢測大于1 000 copy/mL病毒學(xué)治療失敗艾滋病患者進(jìn)行HIV-1耐藥基因變異研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2008-2013年福建省籍且接受抗病毒治療滿1年以上，病毒載量檢測值大于1 000 copy/mL的病毒學(xué)治療失敗艾滋病患者進(jìn)行耐藥性檢測分析。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1病毒載量檢測 參照《HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南》(2013版)，選用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸定量檢測試劑盒(探針法)提取RNA和反應(yīng)液的配置，并運用ABI公司的Real-time 7000進(jìn)行實時熒光定量PCR測定，檢測范圍為2.5×102～1×108。所以操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 自建基因型耐藥檢測 參照QIAGEN公司QIAamp Viral RNA分離試劑盒提取研究對象血漿中病毒核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)，并采用自建基因型耐藥檢測方法(In-house)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴增，并參照《HIV-1基因型耐藥檢測及質(zhì)量保證指南》(2013版)，通過套式聚合鏈反應(yīng)擴增覆蓋蛋白酶基因全序列以及反轉(zhuǎn)錄酶1-300位密碼子序列，擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化和序列測定。擴增和測序所用引物參考《HIV耐藥監(jiān)測策略和檢測技術(shù)》，見表1。

1.2.3 耐藥程度分析 測序得到的序列利用ChromsaPro和BiEdit軟件進(jìn)行初步的質(zhì)量評估，編輯，拼接，混合堿基判讀等一系列流程后將序列上傳美國斯坦福大學(xué)HIV-1耐藥基因型檢測數(shù)據(jù)分析和解釋系統(tǒng)(HIVDRDB)進(jìn)行耐藥程度分析。獲得蛋白酶，反轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸編碼位置，病毒亞型及與數(shù)據(jù)庫中同亞型序列的同源性，序列質(zhì)量及耐藥位點及解釋等基本信息。根據(jù)耐藥突變位點得到某種藥物的單分值，然后累計得到該藥物的總分值，按照總分值來判斷耐藥程度，0～9分為敏感，10～14分為潛在耐藥，15～29分為低度耐藥，30～59分為中度耐藥，60分以上為高度耐藥。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 2008-2013年在對我省籍治療滿1年及以上的艾滋病患者病毒載量檢測中共發(fā)現(xiàn)226份病毒載量大于1 000 copy/mL樣本，其病毒載量平均值為1.62×105copy/mL；男性169例，占74.8%，女性57例，占25.2%；平均年齡為38.7歲，其中最小者4歲，最大者79歲。226例樣本中初始治療方案中主要為NVP+3TC+AZT，共109例，占48.2%；EFV+3TC+AZT共有54例，占23.9%；EFV+3TC+D4T和NVP+3TC+D4T分別為22例和33例，分別占9.7%，14.6%；另外其他治療方案有8例。

2.2 耐藥基因擴增和測序結(jié)果 226例樣本中，124例經(jīng)自建基因型耐藥檢測RT-PCR擴增陽性，擴增陽性率為54.9%。將擴增出來的片段進(jìn)行基因序列測序，獲得124份完成基因序列。

2.3 病毒亞型分析 124例完整基因序列，經(jīng)美國斯坦福大學(xué)HIV-1耐藥基因型檢測數(shù)據(jù)分析和解釋系統(tǒng)結(jié)果顯示，主要為CRF_01AE亞型，共92例(74.2%)；其次為B亞型，共有14例(11.3%)；C亞型和BC亞型分別各7例(分別5.65%)；另外還有4例為其它亞型。

2.4 耐藥情況 將124例完整基因序列，上傳美國斯坦福大學(xué)HIV-1耐藥基因型檢測數(shù)據(jù)分析和解釋系統(tǒng)結(jié)果顯示， 77例對反轉(zhuǎn)錄酶以及蛋白酶抑制劑有不同程度耐藥；其中對核苷類和非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥分別有63例(50.8%)和74例(59.7%)，對蛋白酶抑制劑耐藥9例(7.3%)；，具體情況見表2、表3、表4。

2.5 主要耐藥位點 核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要耐藥位點包括了M184V、M41L、D67N、L70R、T219F、K219Q等，見表5；非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制主要耐藥位點包括K101E、Y181C、K103N、G190A等，見表6；對蛋白酶抑制劑基因主要耐藥突變位點集中在46、54、82、84位密碼子，見表7。

表5 124例HIV-1耐藥毒株中核苷類反轉(zhuǎn)錄基因區(qū)主要耐藥位點

表6 124例HIV-1耐藥毒株中非核苷類反轉(zhuǎn)錄基因區(qū)主要耐藥突變

表7 124例HIV-1耐藥毒株中蛋白酶抑制劑基因區(qū)主要耐藥位點

3 討 論

我國艾滋病抗病毒治療起步較遲，但中國疾病預(yù)防控制中心的專家們早在2003年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了HIV耐藥毒株。HIV耐藥的出現(xiàn)不僅使患者抗病毒治療效果下降，乃至完全失敗，更為重要的是，一個國家或地區(qū)全面開展艾滋病抗病毒治療期間HIV耐藥毒株的出現(xiàn)和流行，將帶來嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

目前越來越多的艾滋病患者接受抗病毒治療?？共《局委熣攘舜笈滩』颊叩纳?，提高了生活質(zhì)量。福建省接受抗病毒人數(shù)從2005年開始啟動免費抗病毒治療時的100多人發(fā)展到2013年2 000多人。但是治療人數(shù)的大量增加以及隨著抗病毒治療時間的延長，加上藥物選擇壓力和HIV病毒本身的高突變率和快速復(fù)制等原因均可導(dǎo)致病毒遺傳物質(zhì)的藥物靶基因發(fā)生突變，并逐漸替代野生毒株成為優(yōu)勢毒株導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[4-5]。如果HIV耐藥毒株的出現(xiàn)并流行，并且不能提供充足的二線藥物的現(xiàn)實的基礎(chǔ)上，意味著被拯救的生命將再次面臨死亡的危險，來之不易的病病毒治療的成果將毀于一旦。

目前HIV-1耐藥性檢測的方法主要有基因型和表型檢測兩種方法。其中基因型因為其簡單、快速、費用低等優(yōu)點被國際上廣泛運用于HIV-1耐藥檢測。國內(nèi)同樣也有很多省份開展HIV-1耐藥基因型檢測。我省從2008年開始對HIV-1病毒治療失敗艾滋病患者(病毒載量檢測大于1 000 copy/mL)開展基因型耐藥檢測。顏蘋蘋等2008年研究已發(fā)現(xiàn)8例樣本對NRTI及NNRTI表現(xiàn)出至少對3種藥物高度耐藥，常見的突變位點為G190A、K103N和M184V,造成對NVP和3TC的高度耐藥[6]。為了全面了解我省HIV-1耐藥基因突變情況，本次研究綜合分析2008-2013年福建省基因型耐藥檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)226例病毒學(xué)治療失敗艾滋病患者中有77例表現(xiàn)對反轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶有不同程度耐藥，其中主要對核苷類和非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑產(chǎn)生耐藥，比例達(dá)到50.8%和59.7%，而對蛋白酶抑制劑耐藥率較低，比為7.3%。研究發(fā)現(xiàn)的主要耐藥位點突變情況與國內(nèi)外其研究結(jié)果類似[7]，核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要耐藥突變包括了M184V、M41L、D67N、L70R、T219F、K219Q等，造成對3TC、AZT、D4T等不同程度耐藥；非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制主要耐藥突變包括K101E、Y181C、K103N、G190A等，造成對NVP和EFV不同程度耐藥。

本次研究結(jié)果說明，福建省的耐藥突變率還較低，但耐藥性突變累積的現(xiàn)象有所增加，發(fā)現(xiàn)了一部分AIDS患者出現(xiàn)對反轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制劑耐藥情況，一旦耐藥毒株成為優(yōu)勢毒株，就可能將帶有耐藥突變的毒株傳播給未治療的患者，因此，從未治療過的患者也有可能耐藥。因此應(yīng)繼續(xù)加強耐藥性檢測，及時評估治療失敗患者耐藥性情況，為減少我省HIV-1病毒耐藥株的傳播，降低艾滋病患者的發(fā)病率和死亡率，制訂預(yù)防耐藥發(fā)生措施提供依據(jù)。

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Evaluation on drug-resistant gene mutation of HIV-1 strains in Fujian Province, China, 2008-2013

WANG Zheng-hua,WU Shou-li,ZHANG Chun-yang,YAN Ping-ping

(Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350001, China)

To evaluate the drug-resistance gene mutation of HIV-1 strains in Fujian Province, 226 samples with viral load of HIV-1 in plasma above 1 000 copy/mL were collected from 2008 to 2013. The average of viral load was 1.62×105copy/mL. Then the whole sequence of gene including the pol gene and the partial reverse transcriptase gene of HIV-1 were amplified by RT-PCR, in which 124 samples were amplified successfully and then the sequences of those amplified ones were edited by the software Conting Express and submitted to the website http//hivdb.stanford.edu./to analyze the drug resistance status. It was found that 92 samples (74.2%) of that strains were classified as CRF_01AE, 14 samples were B, C and BC were 7 samples, respectively. According to the interpretation of Stanford University drug resistance database, 63 of 124 sequences occurred mutations for NRTIs, 74 of 124 sequences occurred mutations for NNRTIs, and 9 of 124 sequences occurred mutations for PIs. The NRTI resistance mutations were M184V, M41L, D67N, L70R, T219F, and K219Q, which caused high or medium level of resistance to TDF, 3TC, D4T and so on. The NNRTI resistance mutations were K101E, Y181C, K103N, and G190A, which caused high or medium level of EFV and NVP. These results showed that the rate of total drug resistance mutation of HIV-1 in Fujian Province was low. But with the increase of the populations using highly active anti-retrovirus therapy and the length of the time during therapy, the mutation may cause high or medium level of drug resistance, so the surveillance for that of HIV-1 is necessary.

HIV; antiretroviral therapy; drug resistance; mutation

Yan Ping-ping, Email: 406040286@qq.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.008

顏蘋蘋，Email：406040286@qq.com

福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

R373.9

A

1002-2694(2015)04-0330-04

2014-07-17；

2014-10-29